تولید پروتئین نوترکیب مزایا و چالش ها(بخش اول) ,

برای تولید پروتئین نوترکیب انتخاب میزبان مناسب بسیار مهم است. طیف گسترده ای از میزبان ها برای بیان پروتئین ها در دسترس است. پروتئین ها را می توان در کشت های سلولی باکتریایی، مخمر ، قارچ های رشته ای، حشرات ، پستانداران یا گیاهان تولید کرد. علاوه بر کشت های سلولی تولید پروتئین ها در گیاهان و حیوانات تراریخت نیز امروزه مرسوم است. پروتئین های بزرگ عموما در سیستم های یوکاریوتی و پروتئین های کوچک در سیستم های پروکاریوتی بیان می شوند.

E.coli با توجه به مزایای بسیاری که دارد اولین و گسترده ترین میزبانی است که برای تولید پروتئین های نوترکیب استفاده می شود. تولید پروتئین نوترکیب در E.coli با یکسری چالش ها نیز روبرو است که این چالش ها در رابطه با عدم تولید پروتئین، شکل گیری اینکلوژن بادی، غیر فعال بودن پروتئین های تولید شده و عدم انتشار برخی از مقالات در رابطه با تولید پروتئین نو ترکیب است . با وجود معایبی که در رابطه با E.coli ذکر شد این سیستم همچنان به عنوان سیستم غالب در بیان پروتئین های نوترکیب به کار خود ادامه می دهد چرا که با انجام یکسری استراتژی ها می توان بر این مشکلات غلبه کرد.

  بخش اول: میزبان های بیان پروتئین نوترکیب

• مقدمه:

از اوایل سال 1900 زمانیکه تنها منابع اصلی دردسترس گیاهان و حیوانات بودند،پروتئین ها به عنوان نهادهای درمانی مهم در نظر گرفته می شدند.با استخراج انسولین از پانکراس خوک در سال 1920، استفاده از پروتئین ها آغاز گردید. با این حال در سال 1970 با ظهور تکنولوژی DNA نوترکیب مشاهده گردید که پروتئین های دارویی نوترکیب می توانند به وسیله ی E.coli با یک روش قدرتمند و مقرون به صرفه تولید شوند. در اوایل 1980 با تایید انسولین نوترکیب تولید شده به وسیله ی E.coli برای درمان دیابت توسط FDA درهای جدیدی را بر روی تولید سایر داروهای نوترکیب گشود. از آن زمان علاوه بر E.coli میزبان های مختلفی مانند مخمر،قارچ های رشته ای سلول های حشرات،سلول های پستانداران و گیاهان و جانوران تراریخت برای تولید داروهای نوترکیب مختلف استفاده می شوند. امروزه بیش از 151 داروی نوترکیب مجزا توسط    و   EMA برای اندیکاسیون های کلینیکال مختلف تاییدیه گرفته اند که یک سوم از این پروتئین ها در E.coli تولید می شود.

• روش های تولید پروتئین

روش سنتز شیمیایی اگرچه روش کارآمدی برای تولید مولکول های کوچک است ولی فرآیند پیچیده و هزینه بری است و برای تولید پروتئین هایی که به اندازه کافی پیچیده هستند مناسب نیست بنابراین تولید در مقیاس بالای پروتئین ها عمدتا مستلزم تولید در سیستم های زنده است. از سوی دیگرایزوله کردن پپتیدها و پروتئین ها از منابع طبیعی فرآیند فشرده و زمان بری می باشد و تولید در مقیاس بالا را با مشکل مواجه می کند .خوشبختانه تکنولوژی DNA نوترکیب ابزار مقرون به صرفه ای را برای تولید پروتئین ها فراهم آورده است پروتئین ها با استفاده از مهندسی پروتئین و مهندسی ژنتیک به صورت تجاری در صنایع تولید می شوند.پروتئین های طبیعی و نوترکیب بخش عمده ای از صنعت زیست دارو صنعت آنزیم و صنعت کشاورزی را به خود اختصاص می دهند. با استفاده از مهندسی ژنتیک ، پروتئین های مورد نظر در پاسخ به نیازهای صنعت به طور انبوهی تولید شده اند.از اینرو امروزه بیشتر محصولات زیست دارو به روش نوترکیب تولید می شوند .. نمودار 1-1 روند رو به رشد فروش زیست داروها را نشان می دهد.

نمودار1-1:میزان فروش سالیانه ی زیست داروها در طی سال های 2010 تا 2013.

• انتخاب میزبان مناسب

برای تولید پروتئین ها انتخاب میزبان نوترکیب مناسب بسیار مهم است. معیارهایی که برای انتخاب میزبان در نظر می گیرند عبارتند از:

• فاکتورهایی که در رابطه با خود پروتئین است شامل: وزن پروتئین، تعداد باندهای دی سولفیدی ، نوع تغییرات پس از ترجمه که باید بر روی پروتئین اعمال شود، مقصد پروتئین بیان شده و کاربرد پروتئین خالص سازی شده
• هزینه تولید و تخلیص
• توانایی کنترل محصول نهایی که شامل فرآیندهای پس از ترجمه است
• زمان لازم که صرف فرآیند از ژن تا پروتئین نهایی می شود
• مسیر قانونی برای تایید یک دارو که بر روی یک سیستم بیانی خاص تولید شده است
• حق امتیاز کلی که در رابطه با تولید محصول نوترکیب در یک پروتئین خاص وجود دارد.

طیف گسترده ای از میزبان ها برای بیان پروتئین ها دردسترس است.پروتئین ها را می توان در کشت های سلولی باکتریایی،مخمر،قارچ های رشته ای،حشرات ، پستانداران یا گیاهان تولید کرد.علاوه بر کشت های سلولی تولید پروتئین ها در گیاهان و حیوانات تراریخت نیز امروزه مرسوم است. پروتئین های بزرگ عموما در سیستم های یوکاریوتی و پروتئین های کوچک در سیستم های پروکاریوتی بیان می شوند.

1-3-1- گیاهان تراریخت

استفاده از گیاهان تراریخت دارای یکسری مزایا می باشد از جمله:

• مقرون به صرفه بودن

• تولید سطح بالایی از پروتئین در گیاهان

• فرآیند اتقال ژن نسبتا آسان

• ایمنی بالا و اندک بودن خطر آلودگی به پاتوژن های حیوانی

• کمتر بودن زمان صرف شده برای رسیدن به محصول نهایی نسبت به کشت سلول های پستانداران و حیوانات تراریخت

• تا خوردن مناسب پروتئین و شکل گیری تغییرات پس از ترجمه

• ذخیره سازی راحت تر نسبت به کشت سلول های حیوانی و حیوانات تراریخت

• نسبتا ساده و ارزان بودن تولید در مقیاس بالا: رشد در مقیاس کشاورزی تنها نیازمند آب ،مواد معدنی و نور خورشید است در حالیکه کشت سلول های حیوانات فرآیند بسیار ظریف و گرانی می باشد و نیازمند بیوراکتورهایی است که برای تولید در مقیاس تجاری باید تا چند صد میلیون برای آنها هزینه شود هزینه شود.

علیرغم آنچه در بالا ذکر شد، تولید پروتئین نوترکیب در گیاهان دارای یک سری معایب می باشد. احتمال آلودگی با آفت کش ها، علف کش ها و متابولیت های گیاهی سمی وجود دارد . همچنین خالص سازی پروتئین ها به علت حضور پروتئاز ها و موادی مانند پلی فنول که به خوبی توسط بیماران تحمل نمی شوند با مشکل مواجه است. بعلاوه اضافه کردن کربوهیدرات ها به زنجیره هیدروکربنی در گیاهان مشابه سلول های حیوانی نیست.پروتئین هایی که در گیاهان ساخته می شوند بجای اسیدسیالیک انتهایی حاوی زایلوز هستند که ممکن است بدن بیمار را وادار به پاسخ ایمنی کنند. یکی از نگرانی های اصلی که در رابطه با تولید پروتئین در گیاهان تراریخت وجود دارد مسائل اخلاقی مربوط به آن است. زمانی که یک گیاه تراریخت در محیط باز کشت داده می شود سبب انتشار غیرقابل کنترل پروتئین ها و در نتیجه آنتی ژن ها می گردد. مقداراندک این آنتی ژن ها ممکن است یک مقاومت کم در انسان القا کنند و یا مانند یک واکسن ناشناخته انسانی عمل کند. این مشکل را نمی توان به آسانی حل کرد . برای حل این معضل راه کارهایی ارائه شده است. راه کار اول شامل نگهداری گیاهان در محیط های استریل مانند گلخانه ها، برای پیشگیری از هرگونه انتشار ترانسژن ها است که البته به طور قابل ملاحظه ای هزینه تولید را افزایش می دهد . راه کار دوم محدود کردن تولید پروتئین های نوترکیب به گیاهانی است که برای انسان استفاده نمی شوند مانند تنباکو و یونجه. علاوه بر دو راه کار گفته شده استفاده از گیاهانی که در مقدار زیاد، باهزینه کم و درمناطق محدود کشت داده می شوند و یا کشت دادن سلول های گیاهی نیز امکان پذیر است. لازم به ذکر است که روند تولید دارو با استفاده از گیاهان ترانس ژن بسیار آرام است.

حیوانات تراریخت

حیوانات تراریخت برای تولید پروتئین های نوترکیب در شیر، سفیده تخم مرغ، خون ، ادرار و پیله ی کرم ابریشم استفاده می شوند.حیوانات تراریختی مانند بز، موش، گاو،خوک،خرگوش،گوسفند و برخی از حیوانات آبزی برای تولید پروتئین های نوترکیب توسعه یافته اند . در حال حاضر عمدتا دو سیستم تولید پروتئین در حیوانات تراریخت استفاده می شود که شامل شیر تراریخت و سفیده تخم مرغ است.به وسیله این دو سیستم پروتئین هایی مانند Human antithrombin III ، هورمون های رشد،فاکتورهای خونی ، فاکتورهای رشد و سایتوکین ها تولید شده اند . مزایای این سیستم عبارت است از:

• میزان پروتئین نوترکیب تولید شده از طریق حیوانات تراریخت بسیار بالاست .بعنوان مثال گاو در روز 30 لیتر شیر تولید می کند که حاوی 35 گرم بر لیتر از پروتئین است و بنابراین تولید کلی پروتئین مورد نظر در روز 1 کیلوگرم است.

• پروتئین تولید شده عمدتا به فرم فعال و طبیعی است

مقرون به صرفه بودن تولید پروتئین در شیر نسبت به تولید با کشت سلولی پستانداران

• تاکنون عوارض جانبی از این محصولات ارائه نشده است.

• مسائل اخلاقی که در رابطه با گیاهان تراریخت وجود داشت در مورد حیوانات تراریخت وجود ندارد چرا که شانس اینکه حیوانات از محیط پرورش خود فرار کنند بسیار پایین است. بعلاوه در اکثر موارد حیوانات از بیان پروتئین خارجی در شیر یا تخم مرغشان رنج نمی برند

علیرغم مزایای ذکر شده بیان پروتئین نوترکیب در حیوانات تراریخت با چالش هایی روبرو است. از مشکلات این سیستم بیان پروتئین نوترکیب این است که دست یابی به محصول نهایی بسیار طولانی است و هزینه های نگهداری بالا می باشد. بعنوان مثال هزینه نگهداری یک گاو تحت روش های خوب کشاورزی 10000 دلار در سال است

1-3-3- سلول های پستانداران

کشت سلولی پستانداران معروفترین سیستم ها برای بیان پروتئین های گلیکوزیله هستند. مزایای این سیستم عبارت است از:

• اغلب پروتئین گلایکوزیله تولید شده توسط این سیستم الگوی گلیکوزیلاسیون مشابه انسان دارند.

• پروتئین های تولید شده به درستی تا شده اند و در نتیجه نیاز به رینیچر شدن از فرآیند تولید پروتئین حذف می گردد.

• سلول های یوکاریوتی می توانند برای اضافه کردن زنجیره اسیدهای چرب و فسفریله کردن گروه هیدروکسیل تیروزین،ترئونین و سرین به کار بروند

علیرغم اینکه این سلول ها گزینه بسیار خوبی برای تولید پروتئین های گلایکوزیله هستند دارای یکسری مشکلات می باشند. این سلول ها ترشح کننده های ضعیفی هستند. بعلاوه فرآیند کشت سلول های پستانداران به منظور تولید پروتئین های نوترکیب به دلیل گران بودن محیط کشت و فاکتورهای رشد پر هزینه است. بعنوان مثال هزینه تولید یک گرم انسولین 375 دلار وبرای تولید هر گرم اریتروپویتین باید 840000 دلار هزینه کرد. فرآیند کشت سلول های پستانداران این پتانسیل را دارد که به وسیله ویروس ها آلوده شود. همچنین انتخاب لاین سلولی مناسب معمولا هفته ها طول می کشد و کشت سلولی تنها برای مدت زمان محدودی پایدار است