آموزش تکنیک وسترن بلات ,

روش های انتقال پروتئین

در اغلب موارد انتقال پروتئین از غشا به ژل با کمک نیروی الکتریکی صورت می گیرد. این نوع انتقال به انتقال الکتروفورزی معروف است. انتقال الکتروفورزی به دو صورت انجام می شود: انتقال در تانک که به انتقال تر معروف است و انتقال به روش نیمه خشک.
البته می توان به طریق انتشار با خاصیت مویینگی یا پمپ خلا نیز پروتئین ها را انتقال داد.

غشاهای مورد استفاده در بلاتینگ

در عمل بلاتینگ معمولا از غشاهای نیتروسلولزی و یا پلی وینیلیدن دی فلورید (PVDF) استفاده می کنند. این دو غشا ظرفیت خوبی در اتصال به پروتئین ها دارند. نیتروسلولز ارزان تر است ولی ظرفیت مکانیکی کمی دارد و شکننده می باشد. اندازه منافذ نیتروسلولز بین ۰٫۰۵ تا ۰٫۴۵ میکرون متغیر می باشند. هرچه اندازه منافذ یک غشا کوچک تر باشد سطح مخصوص و ظرفیت اتصال آن بیشتر خواهد بود.

دی آزو بنزیل اکسی متیل (DBM)، دی آزو فنیل تیواتر (DPT) و نایلون از دیگر غشاهایی هستند که در موارد خاصی از عمل بلاتینگ بکار می روند. غشاهای نایلونی از ظرفیت و توان مکانیکی بالایی برخوردارند، اما بر خلاف سایر غشاها بار مثبت دارند. از این رو اغلب رنگ های آنیونی که برای پروتئین مورد استفاده قرار می گیرند، به آنها متصل میشوند. در مواردی که جداسازی پروتئین خاصی از غشا مورد نظر باشد، استفاده از غشاهای تعویض یون برای بلاتینگ مناسب می باشد. برای این کار قسمتی از غشا که حوای پروتئین مورد نظر است ، جدا می شود. سپس با قرار دادن قسمت جدا شده در بافر با PH یا قدرت یونی متفاوت ، پروتئین آزاد می شود.

روش انتقال در تانک

روش انتقال در تانک شکل پایه ای انتقال به کمک الکتروفورز می باشد. بدین لحاظ غالبا این روش را معادل الکتروبلاتینگ می دانند. تصویر کلی این روش در شکل زیر آمده است. معمولا انتقال در تانک در بافر تریس-گلیسین انجام می گیرد. این بافر برای جداسازی انواعی از پروتئین ها که به روش SDS-PAGE جداشده اند مناسب است. وجود متانول در این بافر برای جلوگیری از تورم ژل، جداسازی SDS از پروتئین ها و بالا بردن ظرفیت اتصال به غشا است. اما ، متانول بخصوص در غلظت های بالا از عوامل بازدارنده انتقال پروتئین ها محسوب می شود. در بعضی موراد به منظور افزایش حلالیت پروتئین ها مقداری دترجنت (به عنوان مثال SDS با غلظت ۰٫۲ درصد) به این بافر می افزایند. به هر حال باید توجه داشت که دترجنت ها به خصوص در غلظت های بالا از اتصال پروتئین ها به غشا جلوگیری می نمایند.

مواد لازم جهت انجام تکنیک ایمونوبلات

غشای نیتروسلولز با اندازه منافذ ۰٫۴۵ میکرومتر یا غشای ایموبیلون (PVDF)
بافر انتقال حاوی تریس ۲۵ میلی مولار، گلیسین ۱۹۲ میلی مولار و متانول ۱۵ درصد. برای تهیه آن ۶ گرم تریس باز و ۸٫۲۸ گرم گلیسین را در حدود یک لیتر آب مقطر حل کنید. سپس ۲۰۰ میلی لیتر متانول اضافه کنید، حجم نهایی را با آب مقطر به ۲ لیتر برسانید (PH این محلول حدود ۳٫۸ است و نیازی به تنظیم ندارد). بافر را در یخچال قرار دهید تا قبل از استفاده خنک گردد، چون حل شدن متانول در آب گرمازاست.
کاغذ واتمن یا کاغذ الکتروفورز

روش آزمایش

مقداری از بافر تانک را در یک ظرف پلاستیکی یا شیشه ای تمیز بریزید. ژل را پس از بریدن بخش متراکم کننده آن حداقل ۱۰ دقیقه در بافر قرار دهید. با کمک پنس و قیچی تمیز، یک ورقه از غشا به اندازه ژل ببرید. از تماس دست بدون دستکش با
غشا خودداری کنید. غشا را با آب مقطر (برای غشای نیتروسلولز) یا متانول (برای غشای PVDF ) خیس کنید و در ظرف حاوی بافر انتقال دهید. چندین لایه کاغذ صافی متناسب با ابعاد ژل تهیه و همراه اسفنج ها در بافر خیس کنید و در بافر خیس کنید. سپس مطابق شکل زیر اجزای گفته شده را روی هم قرار دهید. این مجموعه از پایین به بالا شامل اسفنج، چند لایه کاغذ صافی، ژل، غشا، چند لایه کاغذ صافی و لایه اسفنج می باشد. بعد از گذاشتن هر لایه، حباب های هوای احتمالی را با یک میله شیشه ای یا لوله آزمایش از حد فاصل لایه ها خارج کنید.

انتقال به روش تر

مجموعه بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم کنید و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده است، قرار دهید. سپس به مدت ۱- ۴ ساعت در شدت جریان ۲۰۰ - ۴۰۰ میلی آمپر الکتروفورز نمایید.

انتخاب بافر در الکتروبلات

انتخاب بافر و استفاده از متانول در بافر بستگی به نوع پروتئین های مورد مطالعه ، شرایط ژل ، نوع الکتروفورز و نوع غشا دارد. همانگونه که قبلا نیز ذکر شد، بافر تریس-گلیسین- برای انتقال اغلب پروتئین ها مناسب می باشد. پروتئین ها در این بافر معمولا بار منفی دارند و به طرف آند حرکت می کنند.

اتصال SDS به پروتئین ها (برای مثال در SDS-PAGE ) نیز به تشدید بار منفی و حرکت آنها کمک می کند. با این حال در بعضی موارد تغییر شرایط بافر تریس-گلیسین یا انتخاب بافر دیگر می تواند انتقال را تسهیل نماید. به عنوان مثال، تجربه نشان میدهد که با حذف متانول در بافر تریس-گلیسین انتقال گلیکوپروتئین های بزرگ به راحتی صورت می گیرد. متانول با زدودن SDS از پروتئین ها و جمع کردن ژل باعث کاهش انتقال این مولکول ها می شود. SDS یک دترجنت آنیونی است و در انتقال پروتئین ها (خصوصا پروتئین های با بار خالص مثبت) تاثیر گذار می باشد. بنا بر این در صورت نیاز، علاوه بر حذف متانول، می توان درصد بسیار کمی از آن را وارد بافر کرد. انتقال در بافر CAPS پنجاه میلی مولار سریعتر صورت می گیرد و با تولید گرمای کمتری همراه است. بدین لحاظ در صورت لزوم می توان از این بافر به جای تریس-گلیسین استفاده کرد. در حالاتی که بلاتینگ به هدف تعیین توالی اسیدهای آمینه در پروتئین ها صورت می گیرد، بافر CAPS مناسب تر است. زیرا حضور گلیسین در بافر موجب اختلال در تعیین توالی پروتئین ها می شود.
بافر بورات سدیم ۱۰ میلی مولار با ۹٫۲ = PH را برای انتقال گلیکوپروتئین ها، پلی ساکاریدها و لیپوپلی ساکاریدها توصیه می کنند. در این بافر ، بورات به واحدهای قندی مواد فوق متصل می شود و به آنها بار منفی می دهد. پروتئین های بازی که در شرایط اسیدی الکتروفورز میشوند، یا پروتئین هایی که با تکنیک ایزوالکتروفوکوسینگ جدا می شوند، را می توان در محلول اسید استیک ۰٫۷ درصد به غشا انتقال داد. در این شرایط پروتئین ها بار مثبت دارند و به طرف قطب منفی حرکت می کنند.

رنگ آمیزی عمومی پروتئین ها در غشا

بعد از بلاتینگ پروتئین ها لازم است اطلاعاتی در مورد کیفیت و کمیت باندهای انتقال یافته بدست آید، یا پروتئین خاصی به هدف مطالعات بعدی (مثلا تعیین توالی) مشخص گردد. برای این کار می توان غشای نیتروسلولز یا PVDF را با مواد مختلف رنگ امیزی نمود . رنگ آمیزی پروتئین ها بسته به هدف آزمایش ممکن است به صورت قابل برگشت و یا غیر قابل بزگشت باشد. پانسو-اس، جوهر هندی، آمیدوبلک و کوماسی آبی از مواد متداول برای رنگ آمیزی عمومی پروتئین ها در غشا هستند. رنگ آمیزی ژل نیز کامل یا ناقص بودن انتقال پروتئین ها را نشان می دهد. باندهای پروتئین در ژل و غشا دقیقا هم موقعیت نمی باشند، زیرا ژل در طی متعادل سازی در محلول انتقال به دلیل وجود متانول ، مقداری کوچک می شود.