اصول کار با PCR بخش اول ,

مواد و وسایل لازم برای  PCR

1- DNA الگو (Template   DNA)

PCR تکنيکي است که به واسطه آن مي توان از يک رشته DNA الگو، تعداد زيادي رشته DNA به دست آورد به شرطي که دو انتهاي رشته ی  DNAکه قصد تکثيرش را داريم کاملا شناخته شده باشد. قطعه ی DNA می تواند محصول استخراج DNA ژنومی،DNA  پلاسمیدی یا حتی محصول  PCRدیگری باشد. چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA  پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل وEDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد. در مواد غذایی روند زیر برای تهیه DNA  وجود دارد.

2- دزوکسي نوکلئوتيد تري فسفات (dNTPs)

چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعهDNA ، بلوک های ساختمانی هستند که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند و باید کنار هم چيده شوند تا رشته مکمل را ايجاد کنند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده، واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتریPCR  باید 5 میکرولیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

3- پرایمرهای Forward و Reverse

پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNAی مورد نظر هستند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف، همانند سازی و تکثیر می گردد. از آنجائيکه DNA دو رشته ای است، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است. پرايمرها دو عمل انجام مي دهند؛ اول اين که محل ژني را که بايد تکثير شود مشخص مي‌کنند و دوم اين که اندازه قطعات تکثير شونده را تعيين مي کنند. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. طول پرايمرها نیز بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي کند. بهتر است دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديک به هم باشند. غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغیر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و نقش بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد.

طراحی پرایمر :

پرایمرهای PCR بصورت کاملا" اختصاصی و مکمل ناحیه مورد نظر DNA هدف طراحی میگردند.

پرایمرها 30-20 باز دارند .اگر پرایمرها خیلی کوتاه باشند ممکن است با بخشهای غیر هدف هیبرید شوند و سبب تکثیر محصولات ناخواسته شوند. پرایمرهای بلند با اینکه موجب تولید محصول اختصاصی میشوند ولی باعث کاهش سرعت هیبرید شدن آن با DNA می شود. به همین دلیل در عمل از پرایمرهایی با طول بیش از  30 نوکلئوتید بندرت استفاده می شود. برای تکثیر توالیهای بزرگ از کلون کردن استفاده میشود. پرایمر باید دمای آنیلینگ بالا داشته باشد. دمای مناسب برای تشکیل هیبریدهای صحیح الگو وپرایمر 1 تا 2 درجه پایین تر از دمای ذوب شدن (T_m) است. فرمول محاسبه دمای ذوبT_m=4(G+C)+2(A+T)  است.  (A+T) مجموع نوکلئوتیدهای آدنین و تیمین موجود در پرایمر و  (C+G)مجموع نوکلئوتیدهای گوانین وسیتوزین موجود در پرایمر است. بهتر است تعداد بازهای دوپرایمر مساوی باشند و از پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند، همچنین نواحی تکرار شونده نداشته باشند. چنانچه بازهای G یا C بصورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر بصورت لوپ در می آید و عملا" سیستم کار نمیکند. انتهای 3` دو پرایمر نباید مکمل باشد زیرا پرایمر دایمر تشکیل می شود. فاصله دو پرایمر باید کمتر از 10 kb باشد (کارآیی همانند سازی برای محصول PCR بیش از 3kb کمتر است). برای پرایمرهایی که برای ایجاد موتاسیون در یک ژن و ایجاد تغییر در محصول PCR طراحی میگردند میتوان درسمت پایه 5` پرایمر یک پروموتور و یا Ribosom Binding Site جایگاه اتصال ریبوزوم تعبیه نمود، همچنین می توان یک Non tanslated leader بین پروموتور و ژن قرار داد تا ناحیه برای شروع سنتز پروتئین مناسب باشد. این کاربرد بنام Expression PCR  گفته می شود. نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast آنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژن های دیگری می توانندAnneal گردند.