اصول کار با PCR بخش دوم ,

4- Taq DNA polymerase

DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)، رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. DNA پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت 5َ    3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد و رشته مکمل را در جهت 3َ  5َ می سازد.

در مرحله همانند سازی، برای جدا نمودن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. در ابتدای طراحی PCR از آنزيم کلینو پليمراز I (DNA پليمراز E.coli) استفاده میشد ولی از آنجا که اين آنزيم به حرارت حساس است، پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای 94 درجه ی سانتی گراد، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود. Saiki يکی از مهم ترين کشفيات در اين زمينه را انجام داد و متوجه شد که باکتريهای چشمه های آب گرم (برای مثال باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) ) دارای DNA پليمرازهايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند. این DNA پليمراز که بطور خلاصه Taq پليمراز ناميده می شود در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار است و دمای اپتيمم عمل آن نيز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد. بنابراین با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نیست و PCR براحتی و به صورت اتوماتيک انجام می شود. در حال حاضر Taq  پليمراز برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنشPCR  استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. مزيت بسيار مهم ديگر Taq پليمراز افزايش حساسيت و دقت PCR می باشد. در دمای پايين (30 درجه سانتی گراد که برای DNA پليمراز E.coli بکار می رفت) پرايمرها ممکن است به جايگاههايی که توالی تا حدودی مشابه دارند نيز متصل شوند، زيرا در دمای پايين تعداد کمتری پيوند هيدروژنی برای اتصال پرايمرها نياز است. بنابراين پرايمرها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می شوند. ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه (دمای اپتيمم فعاليتTaq پليمراز انجام شود اتصال پرايمرها به نواحی غير از ناحیه ی اصلی کاهش می يابد. به اين صورت پس از پايان PCR رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد.

5-  بافر

بافر شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA  الگو (نمونه) کمک می کند. بافر به صورت 10 x ساخته مي شود.

6- کاتیون های دو ظرفیتی(یون های منیزیم یا منگنز) و کاتیون های یک ظرفیتی(یون پتاسیم)

یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیم DNA  polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون (عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم(Mgcl₂)) برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود. غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار اثر بازدارندگي برروي فعاليت آنزيم Taq  پلي مراز دارد و موجب تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) می گردد و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و کاهش میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

7- روغن معدني  mineral oil

برای جلوگیری از تبخیر محلول در دستگاه چرخش حرارتي و در نتیجه افزایش غلظت در بخش های بالائی محلول، معمولا یک لایه روغن (معمولا 50 تا 60 ميکروليتر به محلول واکنش 100 ميکروليتري) بر سطح محلول اضافه مي شود. در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده می شود.

8- ترموسایکلر

دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی) قابل برنامه ریزی برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر می باشد. قبل از تولید این دستگاه، دانشمندان برای انجام PCR از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می کردند که کار بسیار پر زحمتی بود.

9- ظروف مورد استفاده

میکرو پیپت (برای برداشتن مقادیر اندک مورد نیاز برای واکنش PCR در مقیاس میکرولیتر)، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند سمپلر، سر سمپلر) تیپ -جز پلاستیکی که برای کشیدن محلول به میکرو پیپت متصل می شود)، ویال (لوله های درب دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آنها یعنی 200 و 500 میکرو لیتر، که واکنش PCR در آنها انجام می شود) و ظروف نگهداری آنها. محلولPCR معمولا به حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک 2/0 تا 5/0 میلی لیتر تهیه می شود. این لوله ها در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده می شوند.