اصول کار با PCR بخش سوم ,

مراحل  PCR

1- مرحله واسرشت (Denaturation step)

این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه است. زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد. هرچه زمان Ramp (زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد) کمتر باشد نتیجه کار بهتر است و واکنش، زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار می گیرد. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا می شوند و تک رشته های DNA حاصل می گردد.

2- مرحله اتصال (Annealing step) 

دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به 3۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد. در این دما دو رشته هر مولکول میتوانند دوباره به یکدیگر متصل شوند ولی این اتفاق نمی افتد زیرا مخلوط حاوی مقدار بیشتری مولکول های کوچک DNA به نام پرایمر(Primer) است که معمولا از 25-18 باز آلي تشکيل شده اند و به DNAی تک رشته ای الگو متصل می شوند. دمای اتصال در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNA بر اساس قوانین معروف واتسون- کریک دارد و در واقع برگرفته از آن است. همیشه A با T و G با C جفت می شود. بنابراین پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند و رشته الگو همیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.

3- مرحله پليمريزاسيون یا طویل شدن (Extension/elongation step)

آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر- الگو، با اضافه کردن نـوکـلـئـوتـيـد تـري فـسـفـات‌هـاي موجود در محلول بر روی عامل-OH  َ۳ پرایمرها همانند سازی DNA را آغاز کرده و رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو میسازد. دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب می شود. مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز، تعداد بازهای بین دوپرایمر و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه می نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می شود.

4- ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از اين 3 مرحله، چرخه اول تمام مي‌شود و چـرخـه ‌هاي بعدي تکرار چرخه اول است. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده است، در اين مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد. بار ديگر سيستم گرم می شود و در اينجا هشت نسخه بوجود مي آيد، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همين صورت به دنبال چرخه‌هاي متعدد قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدي و به نسبتⁿ2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. به طور مثال یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر می شود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب می شود. لازم به ذکر است که DNA های کوتاه (Short target product) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسی (exponential) و DNA های بلند (long target product) یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود می باشند بصورت تصاعد حسابی (linearly) زیاد می شوند.

5- مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation)

این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند. دمای لوله ها و فواصل زمانی تابع عوامل مختلفی از جمله نقطه ذوب پرایمرها (T_m)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها است.

6- نگهداری نهایی (Final hold)

در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

7- ردیابی (detect) محصول PCR

نهایتا می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریلامید، هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (پروب)، الکتروفورز نمودن همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) و یا رنگ آميزی اتيديوم برومايد بررسی نمود.