انواع PCR بخش پنجم ,

واکنش زنجيره پليمراز زمان واقعی RT-PCR مناسب برای مواد غذایی

  BAX Dupont-Qualicon

این آزمون بر مبنای استفاده از پرایمرهای ویژه عامل بیماری زا متصل به یک ماده رنگی می باشد که امکان تشخیص تولید آمپلیکون را در طی هر چرخه مشخص میکند. یک مرحله غنی سازی پیش از استخراج DNA مورد نیاز است. تکثیر محصول با استفاده از رنگ فلورسنت  SYBR Green I تشخیص داده میشود. برای تشخیص و Campylobacter spp, Listeria  monocytogenesو Salmonella  spp وE.coli O157:H7 در گوشت خام، جوجه خام، پنیر، آب پرتقال، شیر، تخم مرغ پاستوریزه شده و ....به کار رفته است.

 Food-proof Roch

این آزمون بر مبنای تشخیص در لحظه DNA حاصل از spp Salmonella و Listeria monocytogenes در مواد خام و نمونه های غذایی بر اساس روش Hot start میباشد. قبل از استخراج و به منظور ارزیابی بازدارنده های PCR  به هر نمونه یک کنترل داخلی اضافه میشود. این آزمون حاوی اوراسیل DNA گلیکوزیداز نیز میباشد تا از آلودگی انتقالی PCRجلوگیری نماید. استفاده از یک  کیت آماده سازی نمونه در این روش(High pure food proof kit) استخراج DNA با کیفیت بالا را تضمین میکند.

IQ-Check BioRad        

در این آزمون که روشی معتبر برای تشخیص Salmonella است از پرایمرها و یک کاوشگر ملکولی راهنما استفاده می گردد، که توسط یک برچسب فلورسنت مختص به ارگانیسم هدف نشاندار شده است. محصولات تکثیر شده در لحظه با تشخیص فلورسنس تعیین می گردند. سیستم شامل یک کنترل داخلی است که با کاوشگر فلورسنتی دیگری نشاندار شده است تا حضور باز دارنده ها را بررسی کند.

واکنش PCR-ELISA مناسب برای مواد غذایی

Probelia Bio Rad

این آزمون مبتنی بر تشخیص آنزیمی یک محصول PCR می باشد که هیبریداسیون DNA : DNA را به کمک گیرنده آن در یک پلیت میکروتیتر با یک الیگوپروب داخلی ترکیب مینماید. به منظور تشخیص Salmonella این آزمون قادر است 3 کلنی در 25 گرم نمونه را با اختصاصیت 99درصد پس از 18 ساعت از مرحله پیش غنی سازی تشخیص دهد.  این کیت تجاری به دو حالت وجود دارد. حالت اول حاوی تمام واکنشگرهای لازم جهت استخراج DNA ، مخلوط تکثیر در یک قالب آماده مصرف و کنترل های مثبت و منفی می باشد. حالت دوم از یک پلیت میکروتیتر،  کاوشگرها، پراکسید کنژوگه و تمام بافرهای مورد نیاز برای هیبریداسیون DNA : DNAو تشخیص آنزیمی فراورده های تکثیر یافته PCR تشکیل میشود.

 AnDia Tec Salmonella sp

تنها نمونه های غذایی که حاوی مقادیر بالایی از بازدارنده ها هستند (نظیر شکلات تلخ و گیاهان بوته ای) به روش استخراجی متفاوت با آنچه در این کیت آزمون موجود است نیاز دارند. کیت مناسب برای تشخیص Salmonella  spp و  Listeria  monocytogenes موجود است.

مورد آزمون های تجاری تایید شده برای تشخیص عوامل بیماریزای باکتریایی در مواد غذایی

AOAC-IR :  اتحادیه بین المللی شیمی تجزیه،  AFNOR: اتحادیه متعارف سازی آحاد فرانسه

NorVal  : سازمان تایید شمال اروپا، USDA-FSIS :  گروه کشاورزی، تولیدات دامی، سلامت غذایی و خدمات بازرسی ایالات متحده

Allele-specific PCR

به منظور بررسی تغییر در فقط یک نوکلئوتید (single-nucleotide polymorphisms) در تشخیص بیماری ها و کلونینگ DNA بکار می رود.

Assembly PCR یا (Polymerase Cycling Assembly: PCA)

یک روش آزمایشگاهی برای سنتز مولکول های DNAی بزرگ است. بدین منظور از الیگونوکلئوتیدهایی استفاده می شود که همپوشانی دارند.

Asymmetric PCR

در این روش فقط یکی از دو رشته DNA تکثیر می شود. پلی نوکلئوتیدهای حاصل بمنظور تعیین توالی یا تولید شاخص های دو رگه مورد استفاده قرار می گیرند.

Helicase-dependent amplification

در این تکنیک برای جدا کردن دو رشته DNA، بجای حرارت از آنزیم هلیکاز (DNA Helicase) استفاده می شود.

Hot-start PCR

برای جلوگیری از تکثیر DNAهای ناخواسته مخصوصا در مراحل اولیه PCR استفاده می شود. بدین منظور قبل از افزودن پلیمراز، دمای محلول به نقطه ذوب (مثلا ۹۵ درجه) رسانده می شود و بلافاصله بعد از دناتوراسیون DNA هدف به واکنش اضافه می شود (استفاده از PCR gem و آنتی بادی آنزیم پلیمراز).

Hot start به کمک آنتی بادی: مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه میکنند درنتیجه فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار میکند. هنگامیکه دمای واکنش به 94 درجه می رسد آنتی بادی دناتوره می شود و دوباره پلیمراز فعال می شود.

Hot start به کمک Ampliwax: به دیواره لوله های مخصوص اینکاربه نوعی واکس آغشته است که بعد از مختصری گرم کردن ذوب شده و روی واکنش را میپوشاند. آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار می دهند. در دمای 94 درجه این واکس بخار می شود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا میکند.

Intersequence-specific PCR

برای انگشت نگاری DNA از طریق تکثیر مناطق بین سکانس های تکراری بکار می رود.

Inverse PCR

کاربرد این تکنیک زمانی است که فقط یک سکانس داخلی شناسایی شده است.

Ligation-mediated PCR

در این روش از DNAهای رابط کوچک (small DNA linkers) که به DNAی مورد نظر متصل شده اند، استفاده می شود. کاربرد این روش در تعیین توالی DNA (DNA sequencing)، genome walkingو DNA footprinting است.

Methylation-specific PCR

این تکنیک توسط Stephen Baylin و Jim Herman در دانشکده پزشکی دانشگاه جان هاپکینز ابداع شده است و بمنظور بررسی متیلاسیون در قطعات CpG (CpG islands) در DNAی ژنومیک بکار می رود.

Miniprimer PCR

در این روش از یک نوع پلیمراز جدید بنام(S-Tbr) استفاده می شود که قادر است به پرایمرهای کوچک ۹ یا ۱۰ نوکلئوتیدی (smalligos) متصل شود. در حالیکه Taq به پرایمرهای بزرگتری متصل می شود که حدود ۲۰ نوکلئوتید دارند. بنابراین با استفاده از S-Tbr، پرایمرهای کوچکتری را می توان طراحی کرد.

Multiplex-PCR

در این تکنیک از چند پرایمر در یک محلول PCR استفاده می شود و آمپلیکونهایی (amplicons) تهیه می شود که اندازه های متفاوتی دارند و مختص DNAهای مختلفی هستند. با هدف قرار دادن چندین ژن در یک محلول PCR، می توان با آزمایشات کمتر و زمان کوتاهتر، اطلاعات بیشتری جمع آوری کرد.

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

در این روش با استفاده از یک جفت پرایمر، می توان چند نوع DNAی مختلف را تکثیر کرد.

Nested PCR

در این روش از تکثیر DNAی ناخواسته جلوگیری شده اثرات زمینه ای کم می شود. مواقعی که DNA هدف در نمونه مورد آزمایش کم باشد برای جلوگیری از بالابردن مقدار DNA و مهار واکنش توسط پرایمرهای خارجی، قطعه طویلتری همانند سازی می شود و از محصول PCR اول که بیشتر DNA هدف همانند سازی شده است یک واکنش دیگر با پرایمرهای داخلی انجام می گیرد. بدین ترتیب در فرآیند تکثیر DNAی هدف، اختصاصی بودن (specificity) افزایش می یابد.

Quantitative PCR

این تکنیک برای بررسی وجود DNA، cDNA یا RNA و همچنین تعیین غلظت آنها بکار می رود. یکی از شاخه های مهم این تکنیک Quantitative real-time PCR است که از نظر صحت (accuracy) در بالاترین سطح قرار دارد و در آزمایشگاه های تشخیص بالینی کاربرد وسیعی یافته است. در روش Q-PCR برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس (نظیر Sybr Green) یا شاخص های DNAی فلورسانس (نظیر TaqMan) استفاده می شود.

RT-PCR

این نوع از PCR بمنظور شناسایی، استخراج یا تکثیر RNA از نمونه های سلول یا بافت مورد استفاده قرار می گیرد. در این تکنیک از ترانس کریپتاز معکوس (reverse tran script ase) برای تبدیل RNA به cDNA استفاده می شود.

PAN-AC

در این تکنیک، سلول های زنده مورد مطالعه قرار می گیرند. به همین دلیل تکثیر DNA در دمای ثابت انجام می شود.

TAIL-PCR

برای جداسازی سکانس های ناشناخته ای بکار می رود که متصل به یک سکانس شناخته شده اند.

Touchdown PCR

یک نوع تغییر یافته از PCR است که موجب کاهش محصول کاذب و پرایمر دایمر می شود. در این روش برنامه PCR به گونه ای طراحی می گردد که در طی سیکل های متوالی، بتدریج دمای مرحله اتصال (Annealing step) کاهش می یابد. بدین ترتیب که در سیکل های ابتدائی، دما در حدود ۳ الی ۵ درجه بالاتر از T_m پرایمر و در سیکل های انتهایی در حدود ۳ تا ۵ درجه پائینتر از T_m پرایمر تنظیم می شود.

Long distance PCR 

با این روش قطعات ببیش از 20 kb همانند سازی می شوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشدو پرایمرها به دقت طراحی شوند. برای اینکاراز klon taq استفاده می شود.این آنزیم نسخه ای از DNA poly است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت 180 به 1 مخلوط می شود و فاقد 5` اگزو نوکلئازی است.

واکنش زنجيره ی پليمراز نسخه برداری معکوس RT-PCR

واکنش زنجيره پليمراز نسخه برداری معکوس (RT-PCR) تعديلی از واکنش PCR برای تقويت اطلاعات محتوی اسيد ريبو نوکلئيک (RNA) توسط تبديل آن به DNA و سپس تقويت آن می باشد. رشته ی RNA در ابتدا به صورت معکوس به مکمل DNA خود يا DNA مکمل نسخه برداری می شود و با تقويت DNA حاصله با استفاده از واکنش زنجيره پليمراز دنبال می گردد. اين می تواند يک فرآيند 1 يا 2 مرحله ای باشد.  PCRنسخه برداری معکوس نبايد با واکنش زنجيره پليمراز زمان واقعی که غالباَ به صورتRT-PCR  خريد و فروش می شود، اشتباه شود.