توضیح کامل تکنیک SDS-PAGE(بخش اول) ,

در واقع مولکول SDS با اتصال به پروتئین ها بار طبیعی آنها را می پوشاند و توزیع یکنواختی از بارهای منفی بر روی آن ایجاد می نماید. در نتیجه این اتفاق، جداسازی پروتئین ها تنها بر اساس وزن مولکولی­شان صورت می گیرد. جهت خطی نمودن مولکول های پروتئینی، آنها را در مقدار کافی SDS ، و ماده احیا کننده مرکاپتو اتانول جهت از بین بردن باندهای دی سولفیدی و نیز دقایقی حرارت قرار می دهند. مقدار SDS لازم جهت اتصال به پروتئین ها، ۱.۴ گرم SDS به ازای هر گرم پروتئین می باشد.

حالا در هنگام ران نمودن الکتروفورز جداسازی پروتئین ها تنها بر اساس وزن مولکولی ­شان خواهد بود. بدین معنا که هرچه اندازه مولکول بزرگتر باشد، حرکت آن به دلیل اصطکاک با محیط اطراف کمتر خواهد بود.

شکل ۱) مکانیسم عمل SDS

معمولا مولکول SDS به قندها متصل نمی گردد، از این رو پروتئین هایی که بخش قندی آنها بزرگ است، نسبت به وزن مولکولی خود SDS کمتری می گیرند. با کاهش اتصال مولکول های SDS در آنها، حرکت کندتری بر روی ژل خواهند داشت. این امر موجب تخمین وزن آنها بیش از وزن طبیعی­شان می­شود. جهت حل این مشکل، می­توان SDS-PAGE را در ژل های دارای شیب غلظتی یا در سیستم های بافری تریس- بورات- SDTA به جای بافر معمول تریس –گلیسین قرار داد. بورات با اتصال به قندها، موجب افزایش میزان بار منفی گلیکوپروتئین خواهد شد و تا حدود زیادی کاهش اتصال به SDS جبران خواهد شد.

اثر ژل پلی اکریل آمید

ژل پلی اکریل آمید نقش بسیار موثری در تفکیک پروتئین ها در SDS-PAGE دارا می باشد. قطر منافذ موجود در ژل پلی اکریل آمید که متاثر از غلظت دو جزء سازنده آن می باشد (C % , T %) دامنه وزنی قابل تفکیک در SDS-PAGE را مشخص می کند. به عنوان مثال در ژل با غلظت ۵، ۱۰ و یا ۱۵ ٪ (با فرض C معادل ۲.۶ درصد) به ترتیب می توان پروتئین های در محدوده ۲۰-۳۰۰ ، ۱۵-۲۰۰ و ۱۲-۱۰۰ کیلو دالتون را جدا نمود. باید در نظر گرفت که رابطه مسافت طی شده و لگاریتم وزن مولکولی در محدوده کمی به صورت خطی می باشد. به منظور افزایش میزان این رابطه خطی، باید الکتروفورز را در شیبی از غلظت ژل پلی اکریل آمید انجام داد.

تکنیک SDS-PAGE در شرایط احیایی و غیراحیایی

پیوندهای دی سولفیدی درون رنجیره ای یا بین زنجیره ای نقش عمده ای در شکل گیری ساختمان سوم و چهارم پروتئین ها دارند. احیای این پیوندها با استفاده از مواد تیول دار (مانند ۲- مرکاپتو اتانول) منجر به از بین رفتن ساختمان های سوم و چهارم پروتئین ها خواهد شد. پروتئین های دارای پیوند دی سولفیدی ، دارای حرکت متفاوتی در شرایط احیایی و غیر احیایی الکتروفورز می باشند.

احیا شدن این پیوندهای دی سولفیدی موجب جدا شدن زیرواحدهای پروتئینی در پروتئین های چند زیر واحدی و همچنین خطی شدن کلیه پروتئین ها می شود که این امر موجب اتصال یکنواخت SDS به پروتئین خواهد شد. بنا براین می­تواند با مقایسه الگوی الکتروفورز احیایی و غیر احیایی یک پروتئین اطلاعات زیادی راجع به ساختار سوم آن بدست آورد. DTT و ۲- مرکاپتو اتانول رایج ترین احیا کننده های پیوند دی سولفیدی می باشند.

مکانیسم عمل مرکاپتو اتانول

شکل ۲) مکانیسم عمل مرکاپتو اتانول

سیستم بافری SDS PAGE

ژل پلی اکریل آمید از دو قسمت ژل متراکم کننده (Stacking gel) و ژل جداکننده (resolving gel) تشکیل شده است. ژل متراکم کننده در بالا قرار گرفته است و مواد تشکیل دهنده آن با ژل جدا کننده متفاوت می باشد. در ژل متراکم کننده به دلیل تراکم یکسان بار الکتریکی کلیه پروتئین ها حرکت آنها با سرعت یکسانی می باشد و به صورت یک لایه نازک در می آیند. اما با رسیدن مجموعه پروتئینی به ابتدای ژل جدا کننده ، جداسازی آنها بر اساس وزن مولکولی شروع می شود. بار خالص پروتئین- SDS در دامنه PH بین ۷-۱۰ تغییر چندانی نمی کند و حرکت پروتئین ها در این دامنه نیز تفاوت محسوسی ندارد.

بافر تریس-گلیسین پر استفاده ترین سیستم بافری ناپیوسته در SDS-PAGE می باشد. در سیستم بافری ناپیوسته ترکیب یونی ، PH بافر در نمونه، ژل و مخازن با یکدیگر متفاوت می باشد. درسیستم بافری ناپیوسته حتی ژل نیز غالبا شامل دو قسمت (ژل بالا و ژل پایین) می باشد. در سیستم بافری ناپیوسته کارایی الکتروفورز خیلی وابسته به حجم نمونه نمی باشد.

در سیستم بافری پیوسته غلظت و ترکیب یون ها و PH در سراسر مسیر الکتروفورز یکسان می باشد.

سیستم بافری لاملی متداولترین سیستم بافری ناپیوسته در الکتروفورز می باشد. در این سیستم نمونه پروتئین و و ژل بالا حاوی بافر تریس- هیدروکلرید با PH=6.8 و ژل پایین حاوی بافر تریس هیدروکلرید با PH=8.8 و بافر مخازن (بافر الکترودها) شامل تریس-گلیسین با PH=8.3 می باشد.

آماده سازی نمونه در SDS PAGE

برای آماده سازی نمونه در SDS-PAGE بافر نمونه را با نسبت خاصی به نمونه می افزایند ، سپس برای دقایقی در آب جوش قرار می دهند. در این شرایط پروتئین ها به واسطه اثر SDS و ماده احیا کننده (در حالت الکتروفورز احیایی) کاملا دناتوره می شوند. میزان SDS در بافر نمونه باید بارها بیشتر از میزان پروتئین باشد (میزان ۳ به ۱) تا کاملا از اشباع شدن پروتئین با SDDS اطمینان حاصل شود.

وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه باعث سنگین شدن نمونه و قرار گرفتن آن در ته چاهک می شود. این موضوع خصوصا زمانی اهمیت بالایی پیدا می کند که مدت زمان نمونه گذاری زیاد طول بکشد.

در SDS-PAGE معمولا بعد از افزودن بافر نمونه به پروتئین و قبل از نمونه گذاری ، مخلوط آنها را دقایقی (۱۵ -۲۰ دقیقه بسته به نوع پروتئین) در آب جوش قرار می دهند. حرارت موجب جداشدن زیرواحدهای پروتئینهای چند زیرواحدی و تسهیل اشباع شدن زنجیرهای پلی پپتیدی با استفاده از SDS می شود. بعلاوه، این کار موجب غیر فعال شدن بسیاری از پروتئیازها شده و امکان تجزیه پروتئین ها توسط آنها را از بین خواهد برد. اما با این وجود بسیار از پروتئیازها در این شرایط سالم باقی می مانند و لازم است مهار کننده پروتئیاز به نمونه ها افزوده شود.

بعضی پروتئین ها تحت تاثیر SDS تنها، رفتاری مشابه با حالت تحت تاثیر SDS و حرارت دارند ولی بعضی پروتئین ها در هر حالت رفتار متفاوتی از خود بروز می دهند.