تولید پروتئین نوترکیب (بخش دوم) ,

1-3-4- سلول های حشرات

میزبانی که  برای کشت درسلول های حشرات استفاده می شود عمدتا Spodoptra Frugiperda است. رایج ترین سیستم وکتوری که برای بیان پروتئین ها در سلول های حشرات استفاده می شود baculovirus است. مزایای استفاده از سلول های حشرات تحت سیستمbaculovirus عبارت است از:

• تغییرات پس از ترجمه صورت می گیرد.
• تا شدن پروتئین ها به شیوه مناسبی صورت می گیرد و باندهای دی سولفیدی تشکیل می شوند.
• به دلیل استفاده از پروموتر قوی پروتئین پلی هدرین ، سطح بیان بالاست.
• وکتورهای بیانی که از baculovirus آماده شده اند می توانند به بی مهره گان حمله کنند اما تاثیری روی مهره داران و گیاهان ندارند و بنابراین ایمنی آنها تضمین شده است.
• اندازه ی پروتئین قابل تغییر است.
• برش سیگنال پپتید به شیوه کارآمدی صورت می پذیرد.
• می توان به طور همزمان چندین ژن را بیان کرد 

این سیستم نیز دارای یکسری معایب است. الگوی خاص فرآیند های پس از ترجمه و بیان باید برای هر سازه ای از لحاظ تجربی تعیین گردد. بعلاوه پروتئین های بیان شده توسط سلول های حشرات که با baculovirus آلوده شده اند با پروتئین های بیان شده توسط سلول های پستانداران متفاوت است. در بعضی مواقع پروتئین ها به درستی تا نشده و درون سلول ایجاد لخته های پروتئینی می کنند. سطح بیان پایین است و الگوی گلیکوزیلیشن نادرست است. در آنالیزهای انجام شده مشخص شده جایگاه هایی که دارای پتانسیل N-linked glycosylation هستند اغلب ، یا کاملا گلایکوزیله هستند یا اصلا گلایکوزیله نشده اند که این با  فرم های قندی مختلفی که در سلول های پستانداران تولید می شود متفاوت است. استفاده از این سیستم کند و زمان بر می باشد.

به دلیل مسائلی که در بالا ذکر گردید اصولا سیستم baculovirus مزیت های کمتری نسبت به سیستم های دیگر مانند سلول های CHO دارند و تنها در حاشیه تولید پروتئین های دارویی قرار دارند 

1-3-5- قارچ های رشته ای

قارچ های رشته ای نیز می توانند بعنوان میزبان بیانی پروتئین های نوترکیب استفاده گردند. مزایای این سیستم عبارت است از:

• قارچ های رشته ای قابلیت ترشح میزان بالایی از پروتئین ها به فرم فعال را دارا هستند.
• فرآیندهای پس از ترجمه در این میزبان انجام می گردد. به عنوان مثال گلایکوزیلیشن در برخی گونه ها مانند Trichoderma ressi مشابه انسان است.

با وجود این مزایا بازده ترشحی برای برخی پروتئین ها پایین است و در برخی موارد پروتئین های تولید شده توسط پروتئازهای قارچی تخریب می شوند 

1-3-6- مخمر

دو سیستم مخمری ،Sacharomyces cerevisiae و Picha pastori برای بیان پروتئین های نوترکیب استفاده می شوند. مخمر قادر است پروتئین هایی با وزن بیشتر از 50 kDa را تولید کند. مزایای این سیستم عبارتند از:

• بازده بالا
• سویه های تولید کننده پایدار
• ماندگاری
• مقرون به صرفه بودن
• رشد با تراکم بالا
• مناسب بودن جهت تولید پروتئین هایی که برچسب ایزوتوپ دارند.
• رشد سریع در محیطی که از نظر شیمیایی تعریف شده است و نیازی به فاکتور رشد ندارد.
• فرآیند تولید مشابه پستانداران
• توانایی ایجاد باندهای دی سولفیدی
• کمک به تا خوردن پروتئین ها
• گلایکوزیله کردن پروتئین ها
• کار کردن با سلول های مخمر نسبت به سلول های پستانداران و حشرات آسان تر و ارزان تر است
• مخمرها به راحتی خود را با فرآیندهای تخمیر سازگار می کنند
• توانایی ترشحی بالایی دارند
• کیت های مبتنی بر مخمرها به راحتی در دسترس است
• به دلیل دیواره مقاومی که دارند حساسیت کمتری به استرس ایجاد شده طی فرآیند تولید از خود نشان می دهند 

گلیکوزیلاسیون مخمرها مشابه پستانداران نیست. گلیکوپروتئین های مخمر به صورت high- mannose است در حالیکه N- گلیکان های انسان عمدتا به صورت هیبرید و کمپلکس است. گلیکوپروتئین های high- mannose در شرایط in vivo نیمه عمر پایینی دارند و ممکن است تاثیر کمی را از خود نشان دهند یا حتی ایمونوژنیک باشند 

1-3-7- E.coli

E.coli اولین و گسترده ترین میزبانی است که برای تولید پروتئین های هترولوگ به کار می رود . بیش از نیمی (55%) از پروتئین های نوترکیب توسط میکروب ها تولید می شوند که 40% آن به وسیله باکتری ها و 15% آن به وسیله مخمر تولید می شود.جالب توجه است که از این 40% سهم مربوط به باکتری ها، 39% را  E.coli به خود اختصاص داده است  مزایای این سیستم شامل:

• رشد سریع
• بیان سریع
• کشت آسان و ارزان
• coli بازده تولید بالایی دارد به گونه ای که می توان تا 80% وزن خشک خود را پروتئین هدف تولید کند.
• ژنتیک آن نسبت به سایر میکروارگانیسم ها به خوبی شناسایی شده است.
• برای بیان پروتئین های غیر گلایکوزیله بهترین گزینه است
• ابزار های ژنتیکی برای بهبود آن در دسترس است.
• کنترل پروموتر آن آسان است.
• تعداد کپی پلاسمید را می توان به آسانی تغییر داد.
• به دلیل زمان کوتاه دو نیمه شدن ارزیابی بیان ژن نوترکیب در coli می تواند در کمتر از یک هفته انجام شود 

E.coli نیز علیرغم مزایای بسیاری که دارد با مشکلاتی مواجه است. بیان باند دی سولفیدی در E.coli با مشکل مواجه است. پروتئین هایی که در E.coli تولید می شوند به صورت غیر گلایکوزیله هستند و به همین دلیل آنتی بادی های تولید شده توسط E.coli در شناسایی پروتئین های پستانداران شکست می خورند. پروتئین با اندوتوکسین ها تولید می شود و کشت در تراکم بالا نیز منجربه تولید استات می شود که روی سلول اثر سمی دارد. اصولا پروتئین هایی که در سیتوپلاسم بیان می شوند تشکیل اینکلوژن بادی  می دهند و نیازمند باز تا خوردن  هستند.همچنین E.coli قادر نیست زیرواحد های پروتئینی را به شیوه ای مناسب سر هم سازد و تولید پروتئین فعال کند 

بخش دوم : چالش های پیش روی بیان پروتئین نوترکیب در E.col 

2-1-1- عدم بیان پروتئین و یا بیان به میزان کم

این وضعیت ممکن است به عنوان بدترین سناریو ممکن در نظر گرفته شود. در این حالت پروتئین مورد نظر نمی تواند از طریق تکنیک های حساس مانند وسترن بلات شناسایی شود و یا اینکه شناسایی می شود ولی در سطح بسیار پایین(کمتر از میلی گرم در یک لیتر از کشت). اغلب مشکل مربوط می شود به تاثیر مضری که پروتئین هترولوگوس بر روی سلول میزبان دارد . عدم بیان پروتئین می تواند ناشی از دو عامل باشد :1-سمیت پروتئین 2-ارجحیت کدونی 

2-1-1-1-سمیت پروتئین

مشکل سمیت پروتئین ممکن است زمانی ایجاد شود که پروتئین نوترکیب یک عملکرد غیر ضروری یا کشنده بر روی سلول میزبان دارد. این عملکرد با تقسیم سلولی نرمال و هموستازی میکروارگانیسم تداخل پیدا می کند و نتیجه ی آشکار آن سرعت رشد و چگالی سلولی کمتر و مرگ می باشد. سمیت پروتئین می تواند ناشی از دو عامل باشد: سمیت ژنی و بیان پایه ی mRNA/پروتئین سمی ، که سمیت ژنی در اینجا مورد بحث قرار نمی گیرد. به منظور کنترل بیان پایه ی mRNA/پروتئین سمیکنترل سنتز پایه توسط پروموترها یکی از گزینه های پیش رو است. فراهم کردن محیط تعریف شده با استفاده از گلوکز به عنوان منبع کربن نیز می تواند انتخاب مناسبی باشد. راه حل دیگر می تواند حذف پروتئین از سلول باشد.گاهی اوقات ترشح به پری پلاسم یا محیط تنها راه برای تولید یک پروتئین نوترکیب است 

2-1-1-2- ارجحیت کدونی

بیان پروتئین های هترولوگ در E.coli و سایرمیکروارگانیسم ها به طور قوی تحت تاثیر ارجحیت کدونی قرار دارد . این پدیده زمانی اتفاق می افتد که کدون استفاده شده مربوط به mRNA کد کننده پروتئین خارجی ، با باکتری متفاوت باشد . این گونه تصور می شد که ریبوزوم در مواجه با یککدون نادر مکث می کند و ممکن است از mRNA جدا شود بنابراین بازده بیان پروتئین کاهش می یابدبعلاوه گفته شده است که برای بهبود بیان پروتئین ها باید کدون های نادر را از طریق جایگزینی آنها با کدون های رایج حذف کرد. بنابراین جایگزینی کدون های نادر با کدون های رایج یک روش کاربردی مرسوم در بیان ژن های هترولوگوس به منظور افزایش بازده پروتئین است. از سوی دیگر مشاهده شد کهدر برخی از موارد این جانشینی منجر به کاهش حلالیت و پایداری پروتئین می شود. در واقع طراحی ژن می تواند منجر به تا خوردن غیر طبیعی پروتئین و درنتیجه کاهش در حلالیت و فعالیت پروتئین گردد[  به نظر می رسد کدون های AGG/AGA ،AUA،CUA،CGA (به احتمال زیاد CGG) و CCC از نقطه نظر ترجمه در E.coli مشکل ایجاد کنند. مطالعات نشان می دهد برای حل این مشکل می توان از پلاسمید حاوی ژن های tRNA مناسب استفاده کرد و یا با سنتز ژن، این کدون ها را از ژن حذف کرد. استفاده از محیط بیانی مناسب هم تاثیر گزار است  به عنوان مثال DNA مواد حساسیت زای بادام زمینی حاوی میزان زیادی از کدون هایی است که در E.coli به میزان کمی استفاده می شوند ،یعنی AGG/AGA . برای افزایش بیان این پروتئین ها در E.coli سویه BL21(DE3) تغییر یافته و سویه BL21-CodonPlus(DE3)-RIL ایجاد گردید که در آن یک کپی اضافی از ژن های tRNA های argU، ileY و leuW وجود داشت. در نهایت بازده کلی به میزان 100 برابر بیشتر از آنچه بود که به وسیله سویه BL21 به دست می آمد . در مطالعه ی دیگری ژن های پارازیت ها را مورد بررسی قرار دادند. ژن های پارازیت ها اغلب حاوی کدون هایی هستند که به ندرت در ژن های با بیان بالای E.coli حضور دارند. برای بیان ژن های پلاسمودیوم با غلبه بر ارجحیت کدونی ،یک روش مهندسی کردن ژن های پلاسمودیوم است به گونه ای که دارای کدون هایی باشد که در E.coli ترجیح داده می شوند اما این روش هزینه بر و وقت گیر است. بنابراین در این مطالعه از انتقال یک پلاسمید که حاوی ژن های مربوط به tRNA کدون های نادر بود استفاده شد و سطح بیان افزایش یافت. در این روش از پلاسمید RIG استفاده شد که حاوی ژن های سه tRNA ،آرژنین، ایزولوسین و گلایسین بود. استفاده از این پلاسمید سطح بیان پروتئین را به میزان زیادی بالا برد 

2-1-2- شکل گیری اینکلوژن بادی

تولید پروتئین های عملکردیدر E.coli نیازمند یک تعادل ظرفیت بین رونویسی DNA ، ترجمه پروتئین و تا شدن پروتئین است. بیان بالای پروتئین نوترکیب در E.coli می تواند تا 30 درصد از کل پروتئین تولید شده در سلول میزبان را به خود اختصاص دهد در حالیکه چاپرون ها و مدولیتور ها به شدت دوز مشخصی دارند. علاوه بر این تا شدن صحیح بسیاری از پروتئین ها نیازمند شکل گیری باندهای دی سولفیدی یا گلیگوزیلاسیون است که در E.coli تشکیل نمی شوند. بنابراین بیان بسیاری از پروتئین ها در E.coli مقدار زیادی از پروتئین های تا نشده      یا اشتباه تا شده  را در سیتوپلاسم ایجاد می کند،جاییکه این پروتئین ها تمایل دارند تجمع یابند و اینکلوژن بادی ها را ایجاد کنند  .اینکلوژن بادی ها به صورت غیر فعال و غیر محلول هستند و در بعضی شرایط یک مانع قابل توجه در به دست آوردن پروتئین فعال هستند. با این وجود در برخی از موارد اینکلوژن بادی ها مفید می باشند چرا که تولید با بازده بالا صورت می گیرد، نسبت به پروتئولیز مقاومند، تغلیظ آنها با سانتریفوژ آسان تر است و حداقل آلودگی را با سایر پروتئین ها دارند  بسیاری از داروهای تجاری و توسعه یافته مانند اینترفرون ها و اینترلوکین ها به صورت اینکلوژن بادی تولید می شوند.

یک روش معمول برای پیشبرد بیان پروتئین ها به فرم محلول و جلوگیری از شکل گیری اینکلوژن بادی ها قرار دادن یک تگ در انتهای N- ترمینال  و یا C- ترمینال پروتئین است که به افزایش حلالیت پروتئین منجر می شود. فیوژن پارتنرهایی که حلالیت پروتئین های نوترکیب را افزایش می دهند عبارتند از :

Glutathione-S-transferase (GST)

Ubiquitin-modifier (SUMO)

Thioredoxin

Maltose-binding protein (MBP)

N-utilization substrate (NusA)

MPB و GST دارای یک برتری دیگری هم هستند به طوریکه می توان از این ها به عنوان تگ تمایلی هم در خالص سازی استفاده کرد. SUMO ، thioredoxin و NusA برای خالص سازی نیازمند تگ تمایلی هستند که معمولا از His-tag استفاده می شود .thioredoxin به دلیل سایز کوچکی که دارد (11.8 kDa) این امکان را فراهم می کند که پروتئین هدف درصد بیشتری از فیوژن را به خود اختصاص دهد. فیوژن GST در بسیاری از موارد به شدت مستعد شکست پروتئولیتیک است و سبب ایجاد پروتئین های ناکارآمد می شود.SUMO قادر است تا شدن را بهبود بخشد و همچنین حلالیت پروتئین مورد نظر را افزایش دهد این تگ هم مانند thioredoxin سایز کوچکی دارد و قادر است نسبت تقریبا بالای پروتئین به پپتید را فراهم کند که تاثیر مثبتی روی بازده پروتئین دارد.