تکنیک نوردرن بلات ,

در یوکاریوت‌ها، بررسی mRNA بسیار موثرتر از DNA ژنومی است. زیرا به دلیل وجود اینترون‌های فراوان در DNA ژنومی، اتصال پروب به توالی صحیح مختل می‌شود. درنتیجه استفاده از این تکنیک بهتر از بررسی کل ژنوم می‌باشد. البته به علت پیشرفت تکنیک real-time RT-PCR، تکنولوژي microarray و توالی یابی نسل جدید RNA، تکنیک نوردرن بلات ، به ندرت مورداستفاده قرار می گیرد

نوردرن بلات نیز همانند Southern blotting، با استخراج و سپس الکتروفورز مولکول‌های mRNA بر اساس اندازه آغاز می شود. مولکول‌های mRNA به علت وجود ریبونوکلئازهای داخل سلولی بسیار ناپایدار هستند. استفاده از مهارکننده‌های ریبونوکلئاز، امکان استخراج مولکول‌های mRNA قابل انتقال به غشا را فراهم می‌کنند. بافر الکتروفورز باید از نوع denaturing باشد (حاوی فرمالدهید) تا از عدم وجود جفت‌بازهای داخل مولکولی یا بین مولکولی اطمینان حاصل کنیم. در غیر این صورت، ممکن است سرعت مهاجرت مولکول‌ها در ژل تحت تاثیر قرار بگیرد.

سپس مولکول‌های mRNA به غشای نایلونی منتقل (blotting) و با پروب‌های DNA تک‌رشته‌ای لیبل‌شده، انکوبه می‌گردند. همانند Southern blotting، پروب می‌تواند با بیوتین، دیگوکسی‌ژنین و مواد رادیواکتیو لیبل شود. غشا پردازش شده و در معرض فیلم یا سوبسترای کروموژن قرار می‌گیرد. پروب‌های مورداستفاده در Northern blotting، مانند Southern blotting، قسمتی از خود ژن بوده و یا الیگونوکلئوتیدی سنتزشده می‌باشند.

در صورتی که از ژن کلون شده به عنوان پروب استفاده شود، نوار ظاهرشده در اتورادیوگراف، رونوشت آن ژن است. اندازه رونوشت نیز می‌تواند از روی موقعیت آن در ژل تعیین شود. درصورتی که RNA استخراج شده از بافت‌های مختلف، به صورت همزمان در ستون‌های مختلفی الکتروفورز شود، می‌توان تغییر بیان ژن موردنظر را در اثر تمایز سنجید. همچنین پس از معین شدن رونوشت، با سنتز cDNA از آن، می‌توان mRNA را به کپی‌های DNA دورشته‌ای تبدیل کرد. این مولکول‌ها می توانند بعدا کلون و توالی‌یابی شوند.

نوردرن بلاتینگ | تکنیک نوردن بلاتینگ | Northern Blotting | تصویر ۲ . هیبریداسیون Northern؛ سه نمونه RNA استخراج‌شده از بافت‌های مختلف در ژل آگارز الکتروفورز شده‌اند. این نمونه‌ها حاوی مولکول‌های RNA فراوانی با طول‌های مختلف هستند و درنتیجه در اثر الکتروفورز اسمیری از RNA ها به دست می‌آید. دو نوار واضح وجود دارند که مربوط به RNAهای ریبوزومی می‌باشند. اندازه این مولکول‌ها مشخص است و درنتیجه می‌توانند به عنوان مارکرهای داخلی سایز استفاده شوند. ژل به غشا انتقال داده می شود، با ژن کلون شده پروب می‌گردد و نتایج با روش‌هایی مانند اتورادیوگرافی، قابل مشاهده می‌شوند. تنها در ستون اول نوار تشکیل می‌شود که نشان‌دهنده بیان ژن کلون شده، تنها در بافتی است که RNA استخراج شده از آن تهیه شده است.