مشکلات PCR بخش ششم ,

با تمامی مزيت های فوق در تکثیر DNA با روش PCR محدودیت هایی نیز وجود دارد که مهمترین آنها اندازه قطعات قابل تکثیر می باشد به طوری که حداکثر اندازه قطعه هایی که با روش PCR معمولی تکثیر می گردد، 5 هزار نوکلئوتید (kb 5) و در روش های بهینه شده تا 20 هزار نوکلئوتید (kb 20) می باشد. مشکل اساسی دیگرPCR  آلودگی نمونه های مورد بررسی است. به دليل حساسيت فوق العاده و قدرت تکثير زياد PCR  هر قطعه DNA خارجی که وارد محيط PCR شود، مورد تکثير قرار گرفته و نتايج عجيب و دور از واقعيتی به وجود خواهد آورد. برای مثال در مورد تحقيقی که در تعيين جنسيت با استفاده از خون مادران باردار بيان شد، در بين جواب ها يک مورد مثبت کاذب برای يکی از زنان غير باردار که به عنوان شاهد منفی استفاده شده بود، وجود داشت. پس از بررسی معلوم شد که تعداد ناچيزی از سلولهای پوست يکی از کارکنان مرد آزمايشگاه وارد لوله ی PCR شده است. گاهی نيز باقيمانده ی قطعات DNA حاصل از تکثير DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود. براي رفع مشکل، امروزه از ظروف يک بار مصرف استفاده مي‌شود. کليه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو مي‌شوند تا سلول‌ها و مولکول هاي موجود در آن ها، تا حد ممکن غير فعال مي‌شوند. يـکــي از روش‌هــاي پـيـشـنهـادي انجـام PCR داخـلــي يـا Nested PCR اسـت. از ايـن روش بـا استفـاده از دو پرايمر قطعه‌اي از DNA را تکثير مــي‌دهـنــد و سـپــس قـطـعــه‌اي ديـگــر در داخـل DNAهــاي تـکـثـيــر شــده PCR مــي‌شــود. بــديــن صورت احتمال آلودگي کاهش مي‌يابد. یکی دیگر از محدودیت های روش PCR ، دناتوره و غیر فعال شدن آنزیم بعد از 25 تا 30 سیکل بعلت حرارت است، همچنین غلظت زیاد رشته های هدف موجب  Reannealing آنها شده و باعث می شود آنها با پرایمرها رقابت کنند.حضور چربی ها، پروتئین ها، آنزیم ها، افزونی های شیمیایی، ترکیبات فیبری و محدوده های متفاوت pH بر فرایند PCR تاثیر می گذارند. ارگانیسم های غیر بیماریزای موجود در فراورده های غذایی تخمیری، ارگانیسم های موجود در خاک و کودهای مصرفی، آلودگی مدفوعی گوشت، نوعی DNA  رقابتی به وجود خواهد آورد. گاهی ترکیباتی به واکنشگرهای PCR متصل شده و آنها را تخریب می کنند به نحوی که مانع از مشارکت آنها در سنتز DNA و انجام واکنش  PCR میگردند این ترکیبات بازدارنده  PCR نامیده میشوند و عمدتا شامل گیرنده های کاتیونی و ترکیباتی هستند که با اتصال به پلیمراز یا  DNA الگو آنها را کاهش می دهند. بازدارنده های اختصاصی در هر نوع ماده غذایی ازجمله گوشت، شیر، پنیر، فراورده های غذایی تازه و ادویه جات و ... یافت میشوند. به عنوان مثال شیر دارای مقدار بالایی کاتیون های ca²⁺، پروتئاز نوکلئاز، اسیدهای چرب و DNA  است. هم، نمکهای صفراوی، اسیدهای چرب، آنتی بادی و کلاژن بازدارنده های PCR هستند که در گوشت و جگر وجود دارند.برای کاهش تاثیر این عوامل جداسازی مناسب عامل بیماری زا از بافت ماده غذایی و یا استفاده از پلیمرازی که نسبت به اثرات مواد بازدارنده حساسیت کمتری داشته باشد پیشنهاد میشود. مثلا برای  PCRگوشت یا پنیر تعدادی از پلیمرازها مانند Tfl  وrTth  بسایر راحت تر از Taq polymerase  عمل میکنند. فعالیت پلیمراز در حضور بازدارنده  با استفاده از برخی تسهیل کننده ها مانند آلبومین سرم گاوی، دی متیل سولفوکسید Tween 20 و بتایین بهبود می یابد. بعضا یک مرحله غنی سازی برای افزایش عامل بیماری زا موثر خواهد بود. برای باکتری ها، ویروس ها و پروتوزواها گیرنده ایمنی (Immunocapture) می تواند مورد استفاده قرار گیرد. فیلتراسیون نمونه های مایع برای تغلیظ عوامل بیماریزایی که از صافی 45/0میکرونی عبور میکنند (کامپلیوباکتر و اجزای ویروسی) میتواند موثر واقع شود.

باید ها و نباید ها در PCR

1-  هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کار تهیه کنید.

2-  اعمال قبل و بعد از PCR جدا از همدیگر انجام گیرند.

3-  برای استفاده ازهر ماده از پیپت جدا گانه و اختصاصی استفاده کنید.

4-  از پیپت هایی که دارای plug هستند و یا از پیپت های یکبار مصرف استفاده کنید.

5-  مواد ذخیره آزمایشگاه را تقسیم کرده و فریز کنید و هرچند وقت صحت آنها راکنترل کنید.

6-  هنگام استفاده، هرلوله را spin کنید تا موادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند رسوب کنند.

7-  چندین کنترل منفی حین آزمایش Run کنید.

8-  برای انجام آزمایشهای تاییدی ازموادفریز شده استفاده کنید.

9-  هیشه DNA آمپلی فای شده را خارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید.

10-  هنگام کار با PCR product مقداری از آن را جداگانه نگهدارید.