مقدمه ای بر سلول حیوانی و کشت بافت ,

ایجاد سلول های حیوانی و کشت بافتی در ابتدای قرن حاضر به وسیله جولی[1] (1903) شروع شد. تلاش های قبلی در این زمینه شامل نگهداری تکه ای از پوست انسان در شرایط in vitro بود. بر اساس کار جولی سلول ها می توانند در شرایط in vitro زنده مانده و تقسیم شوند. اما شروع واقعی کشت بافت و سلول حیوان به وسیله رز هرسیون[2](1907) با استفاده از بافت قورباغه انجام شد. از زمانی که بافت معده داران پست بدون نیاز به انکوباسیون می توانست تکثیر شود، این احتمال بوجود آمد که می توان همین کار را بر روی بافت پستانداران انجام داد. بارو و کارل[3] (1910) نشان دادند که سلول های حیوانات می توانند در invitro رشد کنند. الکس کارل(1912) از بافت و محتویات جنین به عنوان محیط کشت استفاده کرد. برای 50 سال به طور عمده از
بافت هایی که از بدن موجودات خارج شده بود بیشتر از سلول های آنها برای کشت استفاده
می کردند هرچند بعد از سال های 1915 کشت های سلولی را به طور پراکنده انجام می دادند. همان طور که در مورد گیاهان مطرح است در مورد حیوانات نیز بافت هایی که از بدن آنها خارج می شود اگر به همراه ساختارهایی که به همراه بافت است و نگه داری می شود و این ساختارها به عنوان محیط کشت- بدون توجه به نوع بافت- نقش ایفا کنند، این حالت به عنوان کشت بافت تعریف می شود.

تاریخ پیدایش ژنتیک سلول ها جزئیات بیشتری را در مورد کشت بافتی و سلولی روشن خواهد کرد. به طور کلی اصول کشت بافت به وسیله گروه دکتر ارل[4] در مؤسسه ملی سرطان به دیگران انتقال پیدا کرد. این افراد سلول ها را روی شیشه به طور مستقیم رشد دادند و بافت هایی از تکثیر این سلول ها ایجاد شد و در نهایت توانستند به طور موفق رشد بافت ها را متوقف کنند. تعدادی از افراد این گروه این کار را از طریق مطالعه بررسی فاکتورهایی که از محیط کشت که برای رشد سلول ها لازم است، ادامه دادند. بعضی از این افراد اسم خودشان را به محیط کشت دادند و امروزه به صورت رایج استفاده می شود مثل، فیشر[5]، وای موت[6] و ایگل[7].

* اهداف کشت بافت

توسعه در زمینه کشت بافت به عنوان ابزاری مفید در آزمایش های جدید مورد توجه قرار گرفته است چرا که در این آزمایش ها مطالب زیر دنبال می شود:

1- تولید واکسن های ضد ویروسی

2- تحقیق در مورد سرطان

3- جایگزینی با حیوان زنده

لذا هم ملاحظات اخلاقی در نظر گرفته می شود و هم ارزان تر و سریع تر است.

اخیراً روش های استانداری برای تولید تعداد زیادی از سلول ها، ایجاد شده است و به کمک سرم و محیط هایی که به صورت تجاری وجود دارد کشت بافت به صورت وسیعی در بسیاری از زمینه های تحقیقاتی مثل زیست سلولی، زیست شیمی و فیزیولوژی مورد استفاده قرار می گیرد.

عوامل موثر در کنترل کشت بافت

• PH
• دما
• فشار اسمزی
• O₂
• CO₂

به علاوه از یک یا دو بار پاساژ سلول های کشت شده، ساختار یکپارچه ای از سلول ها به دست می آید، چرا که زمانی سلول ها به صورت شانسی در هر پاساژ با هم مخلوط می شوند، اگر از نظر تعداد، سلولی از سایر سلول ها بیشتر باشد مسیر تکثیر سلولی به سمت سلول غالب حرکت کرده و در نهایت بافت یکسان و یکپارچه می شود.

* مزایا و معایب روش های کشت بافت:

از آن جایی که فوائد و مشکلاتی در روش کشت بافت وجود دارد لذا نباید با بی توجهی نسبت به آن برخورد کرد:

مزایا:

رفتار سلول را در محیط می توان به آسانی تغییر داد و آن را به دلخواه تنظیم کرد.

1- یکسان بودن ژنتیک همه سلول ها به صورت پایدار خواهد بود (این خصوصیت از طریق پاساژهای متوالی بدست می آید).

2- روشی اقتصادی است چرا که به مواد واکنشی (Regent) کمتری نسبت به آزمایش در شرایط invitro احتیاج دارد.

3- محدودیت ها و اشکالات قانونی و اخلاقی که معمولاً در اثر آزمایش بر روی حیوانات مطرح می شود در این روش وجود ندارد.

معایب:

1- باید شرایط محیط را از نظر فاکتورهای فیزیکو شیمیایی کنترل کرد (PH، درجه حرات، فشار اسمزی، O₂ و CO₂ ).

2-قیمت آن نسبت به بافت حیوانی زمانی که از لحاظ مقدار هر دویکسان باشند 10 برابر گران تر است بنابراین زمانی از کشت بافت استفاده می کنیم که مجبور باشیم.

3- ناپایدار بودن کرموزومی )آنیوپلوئیدی[8](

* مارکرهای سلولی

خصوصیت خطوط سلولی مهم است. به طور طبیعی لازم است که یک ارتباط بین محیط کشت و بافتی که از آن متاثر می شود از نقطه نظر توارث و میزان تمایز آن به سلول های بالغ برقرار باشد. ممکن است بتوان خطوط سلولی را باقی نگه داشت ولی ناپایداری در فتو تیپ و ژنوتیپ آن وجود دارد که علت آن تفاوت در شرایط محیط کشت، رشد زیاد و به صورت انتخابی و یا تغییرات ژنتیکی است. بنابراین مهم است که شرایط نگه داری استاندارد باشد و لاین های ذخیره شده طوری نگهداری شوند که بعد از فاصله ای که در طی نگهداری بوجود می آید دوباره به حالت طبیعی خود (رشد و کشت) برگردد. برای رسیدن به این مهم لازم است که سلول ها از نظر، وجود یا عدم وجود آلودگی تقاطعی چک شوند که می توان از مارکرهای پایدار استفاده کرد و اگر لازم باشد که شرایط کشت تغییر کند باید این مارکرها بیان شوند تا ما به تغییرات محیط کشت پی ببریم.

* مورفولوژی سلولی

بیشترین روشی که برای شناسایی سلول ها از آن استفاده می شود مورفولوژی سلول است. مورفولوژی سلول بسته به شرایط محیط کشت فرق می کند. مثلاً سلول هایT₃  موش زمانی که غلظت سلول در محیط کشت کم باشد ظاهری فیبروبلاستیک دارد ولی زمانی که این سلول ها به هم بپیوندند شبیه سلول هایی اپتلیال می شود. برای سال ها از واژه ها فیبروبلاستیک و اپتیلیال برای بیان ظاهر سلول استفاده می کردند و کمتر به منشأ این سلول ها توجه می شد. اگر از این خصوصیت برای معرفی سلول استفاده شود پس می توان گفت:

1- سلولی که طولش از عرض آن بیشتر است ظاهری فیبروبلاستیک دارد.

2- سلولی لایه که طول و عرض منظم تری دارد و از لحاظ اندازه تقریباً طول برابر عرض است سلول اپتلیالی نام دارد.

* دوره رشد سلولی

مدت زمانی که صرف دو برابر شدن جمعیت سلولی می شود دوره های رشد نام دارد، زمانی که صرف می شود تا یک لایه سلول به هم می پیوندند و یا مدتی که لازم است تا رشد کشت سلولی به دلیل رسیدن به غلظت اشباع سلولی متوقف شود باید پایدار باقی بماند. این موضوع در مورد زمان دوره های رشد هم صدق می کند. اگر تغییری در این زمان ها ایجاد شود یا کشت سلولی دچار آلودگی تقاطعی شده است و یا پیر شده است. اگرچه ممکن است این تغییرات به دلیل تغییر ماهیت Transformation (به دلیل آلودگی ویروس) و یا آلودگی با سایر میکروارگانیسم ها باشد.

* انواع سلول ها

سلول ها ممکن است بدون توجه به منشأ آنها به دو گروه اصلی تقسیم شوند. آنهایی که به صورت تعلیق (بدون چسبیدن به سطح کشت) رشد کنند و آنهایی که همانطور که از نامشان پیدا است در حین رشد به محیط کشت می چسبند مثل کشت های اولیه و یا خطوط سلولی که در حال تکامل تدریجی هستند.

* سویه سلولی

زیاد شدن تعداد سلول ها ممکن است از طریق تکثیر سلولی انجام شود. زمانی که سلول ها از محیط کشت پایه انتخاب می شوند و به کشت های بعدی منتقل می شوند، به این کشت های ثانویه سویه سلولی می گویند.

معمولاً این سویه ها بر اساس خصوصیات ویژه ای انتخاب می شوند. کشت هایی که سلول ها در آن معلق است از سلول هایی بدست می آیند که زنده هستند و تقسیم می شوند بدون این که به سوبسترا متصل شوند مثل سلول هایی دودمان خونی، ولی سلول هایی که به تشت می چسبند و یا سلول های تک لایه برای این که زنده بمانند باید به سوبسترا بچسبند. می توان سلول های گوناگونی را که متعلق به دودمان های سلولی متفاوت است، کشت داد مثل کراتینو سایت ها که در انواع سلول های اپتلیال است، سلول های مسیر غدد پستانی، سلول های سرویکال، سلول های مسیر معده-روده، کبد، پانکراس، کلیه، برونشیال و نای، سلول های مزانشیم مثل بافت اتصال دهنده چربی و بافت عضلانی، استخوان و غضروف. سلول های تورو التودرم مثل گلیا و سلول های اندوکراین و سیستم خونی مثل ماکروفاژ و لنفوئیدها. روش های ویژه ای برای کشت این نوع از سلول ها وجود دارد.

* خطوط سلولی اولیه و پایدار[9]

یک تکه از بافت موجود زنده معمولاً پیچیده است و علاوه بر سلول های تخصصی موجود در بافت، سلول های دیگری مثل سلول های اتصال دهنده، سلول های مختلف خونی و سلول های رتیکولو اندوتلیال را شامل می شود. وقتی که یک کشت اولین بار ایجاد می شود حداکثر یک یا دو روز زنده باقی می ماند. در شرایط معمول کشت، بسیاری از سلول ها تقریباً مهاجرت را سریعاً آغاز می کنند. اولین گروه از سلول ها که که مهاجرت را آغاز می کنند ماکروفاژ ها هستند و بعد از آن فیبروبلاست ها به صورت شعاعی در محیط کشت مهاجرت می کنند. اما بسیاری از سلول های ویژه، به صورت ساکن در بافت اتصالی باقی می ماند. مثلاً سلول های عصبی معمولاً در بافت باقی می مانند اگرچه ممکن است اکسون آنها به خارج بافت مهاجرت کند. سرنوشت بعدی سلول ها هم بسیار متنوع است. بسیاری از آنها زندگی کوتاهی دارند مثلاً بیشتر سلول های خونی در طی دو تا سه روز می میرند و از بافت ناپدید می شوند. سایر سلول ها مثل سلول های عصبی و ماهیچه ای اغلب ماهها بدون هیچ گونه تقسیم شدن پایدار باقی مانده و سرانجام آنها هم می میرند.

عده ای از سلول ها نیز تقسیم را به سرعت آغاز کرده و برای یک مدت معین به تقسیم خود ادامه می دهند. عده ای دیگر از سلول ها بعد از این که تغییراتی را طی ماه ها، و یا هفته ها بعد از آغاز تقسیم سلولی متحمل شدند، سرانجام می میرند.

* خط سلولی اولیه[10]

اگر سلول ها به طور مکرر در مدت زمان طولانی تقسیم شوند می توان آنها را پاساژ کرد. به این صورت که سلول های اولیه را در محیط کشت به حالت تعلیق در آورد و سپس آنها را به وسیله لوله به محیط کشت جدید منتقل کرده و آن را انکوبه نماییم. به محض این که سلول ها به این روش پاساژ شدند، محیط کشت خط سلولی اولیه نامیده می شوند.

مزایا:

1- هزینه و مشکلات برای نگهداری و ذخیره سلو لهای ایجاد شده از بین می روند.

2- آنها اغلب برای تولید واکسن مناسب هستند زیرا خطر سرطانی شدن سلول ها و این که سلول ها در طی انتقال به in vitro تغییر ماهیت داده و بدخیم شوند، به حداقل می رسد.

3- مقدار زیادی بافت برای یک دوره کوتاه مدت مطالعاتی بدست می آید.

4- این کشت ها نسبت به شرایط محیطی مقاومت و سختی دارند و می توانند محیط هایی را که از اجزای ترکیبی نسبتاً ساده تشکیل شده است به خوبی تحمل کنند.

5- درجه و دامنه حساسیتشان به عفونت های ویروسی نسبت به خطوط سلولی رایج بسیار بیشتر است.

معایب:

1- این کشت ها ممکن است با ویروس های پنهان آلوده شود (مثل ویروس کف مانند در بافت کلیه میمون).

2- آزمایشات طولانی مدت که مربوط به خواص زیستی سلول ها است را نمی توان بر روی این بافت ها انجام داد.

3- جمعیت های مخلوط از سلول ممکن است تداخل در یافته های پژوهشی ایجاد کنند.

به طور کلی خطوط اولیه سلولی تقسیم را به میزان بالایی در مدت زمان طولانی انجام می دهند و می توان به طور مکرر از آن برداشت کرد. بعد از آن که به دفعات زیاد پاساژ بافتی انجام شد تکثیر در خطوط سلولی اولیه متوقف شده و آنها می میرند ولی گاهی اوقات می توان خطوط سلولی را در مدت زمان طولانی کشت داد. ظاهراً این خطوط سلولی تونایی بالقوه ای در تکثیر دارند و این توانایی مرتب افزایش می یابد و می توان به طور مشخص کشت های بعدی را از این سلول ها در in vitro بدست آورد.

رفتار خطوط سلولی اولیه دقیقا مشابهه خطوط سلولی ساخته شده نیست. زمانی که خطوط سلولی ساخته شده در محیط کشتی که در آن رشد کرده اند پایدار می شوند، معمولا این محیط کشت برای انکوباسیون و رشد سلولی های تازه نا مناسب است. اما معمولا مشاهده می شود که قبل از تخلیه محیط کشت، رشد خطوط سلولی اولیه متوقف می شود. دلیل این اتفاق که ممانعت تماسی نام دارد اولین بار توسط آبروکرومبی[11] و هیزمین[12] توضیح داده شده است.

این دانشمندان نشان دادند، زمانی که سلول های طبیعی مثل فیبروبلاست ها با هم تماس پیدا کنند فوراً از حرکت باز می ایستند. این ویژگی خصوصیت رایج خطوط اولیه سلولی است. نه تنها حرکت سلولی در اثر تماس متوقف می شود بلکه تقسیم سلولی، سنتز DNA، سنتزRNA و پروتئین نیز بسیار کاهش می یابد و یا به طور کلی متوقف می شود، زمانیکه خطوط اولیه سلولی تغییر ماهیت می دهند، یکی از شاخص ترین علائم این تغیر کم شدن اثر ممانعت تماسی است و به همین دلیل است با غلظت های بالاتری رشد می کنند و یا همدیگر را می پوشانند.

بدلیل کم شدن تاثیر ممانعت تماسی در این خطوط کیفیت رشد این سلول ها نیز تغییر کرده و این سلول ها زمانی کیفیت مطلوب را نشان می دهند که انکو باسیون در محیط کشت خیلی رقیق انجام شود. به محض این که صفحات کوچکی از سلول ها با هم برخورد کردند و اثر ممانعت تماسی خودش را نشان داد رشد سلول ها به تدریج کاهش می یابد و آرام می شود.

* خط سلولی پایدار[13]

به طور کلی زمانی به خطوط سلولی، خطوط سلولی ساخته شده می گویند که بتوان حداقل 70 بار کشت های مکرر از آن گرفت به طوری که هر فاصله هر دو کشت جدید سه روز باشد.

تبدیل خط سلولی اولیه به خط سلولی ساخته شده و بسیار آرام و تدریجی انجام می شود ولی گاهی اوقات اتفاقات عجیبی در خط سلولی اولیه روی می دهد که به آن تغییر سلولی Coll alteration و یا تبدیل Transformation می گویند. در طول این تغییر که در خط سلولی اولیه رخ می دهد تعداد کمی از کلنی ها بسیار سریع رشد می کند. منشأ این کلنی های همان سلول های تغییر یافته است. سلول های باقی مانده در کست بسیار سریع رشد کرده و به انواع سلول غالب تبدیل می شوند.

خطوط سلولی ساخته شده که از این راه ایجاد می شود اغلب در بسیاری از جهت از خطوط اولیه سلولی متفاوت است. همه خطوط سلولی اولیه در ابتدا تعداد نرمالی کرموزوم دارند، در حالی که خطوط سلولی ساخته شده دارای تعداد غیر معمول کرموزوم هستند. تفاوت های گونه ای جالبی در مورد پایداری سلول ها وجود دارد.

فیبروبلاست انسانی نمونه کلاسیکی از پایداری خطوط سلولی اولیه است. این سلول ها هیچ گاه به دلیل تغییر شکل به خطوط سلولی پایدار شده تبدیل نمی شوند. (اگرچه می توان آنها را در معرض ویروس های تومور زا قرار داد و در نتیجه آنها را تغییر داد). از طرف دیگر، فیبرو پلاست موش اغلب بسیار آرام تغییر شکل داده و به خطوط سلولی ساخته شده تبدیل می شوند.

* تشابه خطوط سلولی

خطوط سلولی اغلب بدون توجه به ریشه آنها به طور قابل توجهی به هم شبیه هستند زیرا:

1- زمان دو برابر شدن آنها کوتاه است (در حدود 12 تا 20 ساعت)

2- آنها Aneuploid بدون تغییر هستند.

3- این سلول ها بدون توجه به این که منشأ آن چیست به نیازهای تغذیه ای مشابه ای احتیاج دارند.

4- سرعت رشد آنها نسبت به خطوط سلولی اولیه بسیار بیشتر است.

5- این سلول ها جهت یابی فضایی خاصی را در محیط کشت از خود نشان نمی دهند.

6- به ندرت عملکرد خاصی را از خود نشان می دهند.

7- آنها اغلب در محیط های کشت رقیق انکوبه می شوند و رشد می کنند.

8- بیشتر آنها در سوسپانسیونی از محیط کشت ساخته می شوند هر چند استثناهایی در زمینه رشد خطوط اولیه سلولی در سوسپانسیون وجود دارد.

* کینتیک های رشد سلول

- خطوط سلولی ساخته شده:

الگوی رشد سلول ها در محیط کشت شبیه میکرو ارگانیسم ها است. آنها به خصوص الگو رشد کلاسیکی را نزدیک به باکتری، مخمر و پروتوزوآ از خود نشان می دهند. این الگوی رشد دارای فازهای زیر است:

1- فاز کند[14]: رشد در این فاز اتفاق نمی افتد و ممکن است برای ساعت ها یا روزها قبل از رشد سلول طول بکشد.

2- فاز لگاریتمی[15]: در طول این فاز رشد سلول به طور یکنواخت و پایدار پیشرفت می کند و در مواردی که رشد سلول ها سریع است جمعیت هر 15 تا 20 ساعت دو برابر می شود.

3- فاز پایداری[16] : در انتهای فاز لگاریتمی زمانی که حداکثر میزان جمعیت سلولی ایجاد می شود رشد سلولی به پایداری می رسد.

در طول فاز لگاریتمی مطابق فرمول زیر جمعیت سلول ها افزایش می یابد فاکتور kt برابر با تعداد تولید است (n)، تعدا تولید یعنی افزایش از طریق دو تا شدن و تبدیل N₀ به N. لذا به زمان تولید (T)وابسته است .زمان لازم برای دوبرابر شدن جرمیت رابطه عکس باKدارد در نتیجه معادله به این صورت است                                                           

N=N₀2kt

جمعیت اولیهN₀=

تعداد سلول در ساعتN=

ضریب ثابتk=

از آنجایی که    

بنابراین می توان نوشت

در این معادله فرض بر این است که همه سلول های جمعیت تقسیم می شود و میزان این تقسیم در مورد تمام سلول های موجود در جمعیت مشابه است.

در مواردی که قسمتی از سلول ها تقسیم نمی شود و یا حتی ممکن است تعدادی از آنها بمیرند، این محاسبات فقط آن تعداد از سلول ها را نشان می دهد که در حال تقسیم شدن است .

میزان رشد سلول های کشت داده شده لازم نیست که مشابهه باشد. گاهی اوقات ممکن است یک سویه سلولی به سویه ای دیگر تغییر کند اما به طور عمده با تغییر شرایط محیطی مثل PH ، درجه حرارت و فشار اسمزی این سویه ها به هم تبدیل می شود .

* متابولیسم

در سلول های کشت شده متابولیسم گلوکز از طریق مسیر گلیکولیتیک و کربن صورت می گیرد همانطور که بافت های ارگانیسم ها نیز گلوکز به همین صورت می شکنند. اما بسیاری از سلول ها به افزایش اسیدلاکتیک و کتواسید در محیط کشت تمایل نشان می دهند. سلول های کشت شده نیاز های متفاوتی در در ارتباط با اکسیژن دارند. قسمت قابل توجه ای از انرژی مورد نیاز سلول ها در محیط کشت از طریق شکستن اسکلت 6 کربنه کربوهیدراتهایی مثل گلوکز و تبدیل آن به دو مولکول 3 کربنه مثل اسیدلاکتیک و اسید پیرویک بدست می آید. این واکنش نیاز به O₂ ندارد. سلول ها می توانند در مدت زمان کوتاهی در غیاب O₂ رشد کنند. همچنین سلول ها می توانند چربی را از مواد شیمیایی ساده مثل استات سنتز نمایند. برخی از سلول ها نیز قادرند کلسترول را نیز سنتز نمایند. اما تا کنون مشخص نشده که سلول ها می توانند چربی را از محیط کشت برداشت کرده و آن را ذخیره کنند.

سلول های کشت شده می توانند اسیدهای نوکلئیک را از ترکیبات ساده موجود در محیط کشت (مثل فرمات ،گلیسین و بی کربنات) بسازند. آنها این توانایی را دارند که آنزیم های لازم برای این واکنش را تولید کنند.

کاربردهای کشت بافت حیوانات :

روش های کشت سلولی به طور وسیعی در مطالعات تئوری ژنتیک و مطالعات ژنتیک کاربردی مورد استفاده قرار می گیرد.

* کشت بافت جهت تحقیقات زیست – پزشکی بر روی سرطان

روش های کشت بافت برای درک مشکلات موجود در سرطان موجود بسیار مفید بوده است. از زمانی که کشت لنفوس رکومای سگی به وسیله بیب[17] و اونیگ[18] (1904) انجام شد، پیروانش یعنی کارل، واربرگ[19]، ارل روس[20]،کی[21]، مورای وسایر همکاران روی این مشکل کار کردند. بسیاری از ویروس شناسان به دلیل از بین رفتن مشکلات مربوط به کشت بافت، میزان آزمایشات را در مورد ویروس های تومورزا افزایش دادند و به این منظور از روش های کشت بافت بسیار استفاده کردند. از زمانی که طبیعت عفونت زای سارکومای روده توسط روس اثبات شده، سایر عوامل عفونی تولید کننده سرطان تشخیص داده شد.