کاربردهای PCR بخش چهارم ,

1- تشخيص بيماري‌هاي قبل از تولد

با استفاده از PCR و به کار گرفتن پرايمرهاي مربوط به يک ژن بيمار و پرايمرهاي مربوط به ژن سالم آن، مي‌توان از تولد کودکان داراي بيماري‌هاي ژنتيکي جلوگيري کرد. براي اين کار بعد از لقاح تخمک در آزمايشگاه و بعد از رسيدن تخمک به حالت 10 سلولي، تعدادی از سلولهای جنين را استخراج کرده و با پرايمر اختصاصی برای يک ژن بيماری مجاور مي کنند، همچنين بطور جداگانه با پرايمر ژن سالم نيز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند. پس از پايان PCR تفسير آزمايش چنين خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود، جنين يک ژن سالم و يک ژن بيمار دارد يعنی حامل است ولی بيمار نيست. اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بيمار وجود دارد انجام شود جنين بيمار است و بايد سقط شود. اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود، جنين کاملاَ سالم است. امروزه بسياری از بيماريهای ژنتيکی مانند هموفيلی، کم خونی داسی شکل، سيستيک فيبروزي(Cystic Fibrosis )، تالاسمی، سندرم لش – نيهان، ديستروفی عضلانی دوشن، فاويسم، فنيل کتون اوری و غيره را می توان به کمک PCR تشخيص داد.

2- تعيين جنسيت جنين

به طور معمول چند تخمک با چند اسپرم در آزمايشگاه لقاح مي‌يابند و هر يک از سلولهای تخم تشکيل شده را بطور جداگانه کشت می دهند تا اينکه جنين به مرحله ی 10 سلولی برسد. سپس از هر جنين يک سلول را جدا کرده و همراه با پرايمرهای اختصاصی برای کروموزوم y در لوله PCR وارد می کنند. کروموزوم y منحصرا در سلول‌هاي نر ديده مي‌شود. قطعه توليدشده با PCR به وسيله الکتروفورز و به طور دقيق‌تر توسط ساترن بلوتينگ تشخيص داده می شود. فقط در هر لوله که جنين نر ( يعنی کروموزوم y) وجود داشته باشد، سنتز DNA صورت می گيرد. با این روش می توان به اختيار جنسيت جنین را انتخاب کرده و تخم مورد نظر را به مادر انتقال داد. تمامی مراحل بالا يعنی استخراج تخمک از مادر، لقاح، تکثير،PCR  و انتقال مجدد به مادر در مدت زمان يک روز قابل انجام است. راه ديگر تعيين جنسيت جنين استفاده از خون مادر است. در طی دوران بارداری مقداری از سلولهای جنين وارد خون مادر می شوند. حال اگر PCR برای قطعه ی  DYZl (در حدود 5000 نسخه از اين قطعه بر روی کروموزوم y قرار دارد) بر روی خون مادر انجام شود و جواب مثبت باشد چون مادر کروموزوم y ندارد پس اين ژن مربوط به کروموزوم y جنين است و جنس جنين نر تعيين می شود.

3- تشخیص بیماری ها

در مطالعات میکروبیولوژی از روش PCR برای شناسائی عوامل عفونت زا و تشخیص گونه های پاتوژن از غیر پاتوژن نیز استفاده می شود. کشت ميکروب ها که جهت تشخيص بيماري‌هاي عفوني در بيشتر آزمايشگاه ها به کار مي‌رود زمان ‌بر بوده و همچنين باعث افزايش تعداد ميکروب ‌هاي بيماري زا و غير‌بيماري‌زا در شرايط آزمايشگاهي مي شود. بدلیل حساسیت بالای PCR (حساسیت این روش ده هزار برابر روش های معمول است) می توان بلافاصله پس از عفونت و قبل از ظهور بیماری، وجود میکروارگانیسم ها را بررسی و اقدامات درمانی را آغاز کرد.

4- تشخیص سرطان و بررسی مراحل درمان آن

در تشخیص بدخیمی هایی نظیر لوسمی (leukemia) و لنفوم (lymphomas)، سنجش PCR مستقیما بر روی DNAی ژنومی انجام می شود. در هر سلول معمولاَ از يک ژن فقط يک نسخه وجود دارد، و در صورتی که اين ژن دچار جهش شود بررسی اين جهش بسيار مشکل خواهد بود، زيرا در سلول های انسان پيدا کردن يک ژن در ميان کل ژنوم انسان، همانند پيدا کردن سوزن در انبار کاه خواهد بود و پس از پيدا کردن ژن جهش يافته نيز به دليل محدوديت نسخه های اين ژن بررسی کميت و کيفيت جهش در آن مشکل خواهد بود. ولی امروزه PCR کار را بسيار راحت نموده است. کافی است که يک سلول سالم و يک سلول جهش يافته بطور جداگانه برای يک ژن خاص تحت PCR قرار گيرند و محصولات حاصل با هم مقايسه شوند. به اين ترتيب به راحتی می توان محل جهش، نوع جهش و هر نوع اطلاعات لازم ديگر را به دست آورد. استفاده ديگر PCR در بررسی مراحل درمانی سرطان می باشد. داروهای مورد استفاده در درمان سرطان داروهای سيتوتوکسيک می باشد که عوارض جانبی بسيار زيادی به همراه دارند. به همين دليل نيز سرطان شناسان مايل اند که از مراحل بهبودی سرطان اطلاع داشته باشند تا به محض از بين رفتن سلول بدخيم درمان را متوقف نمايند، ولی در صورتی که بهبودی کامل حاصل نشده باشد، احتمال عود مجدد بيماری وجود خواهد داشت. با استفاده از PCR دقت تعيين سلولهای سرطانی بسيار بالا می رود وPCR  منفی را می توان به معنای بهبودی کامل در نظر گرفت.

5- شناسائی میکروارگانیسم هایی که قابل کشت نیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است

با استفاده از روشPCR  و با بررسي حضور يا عدم حضور يک ژن مي ‌توان وجود میکوباکتریها (mycobacteria)، باکتریهای غیر هوازی (anaerobic bacteria) و ویروسها (viruses) را بررسی نمود و بطور مثال تشخيص داد که آيا ويروس ايدز در داخل بدن وجود یا نه؟‌ فرض کنيد بيمار شما به يک بيماري نا‌شناخته گرفتار است و شما احتمال مي دهيد که عامل بيماري ويروس است. اين ويروس را نمي شود به راحتی در آزمايشگاه کشت داد. با روش PCRمي توان احتمال اين ويروس را در عرض 1 ساعت کنترل کرد. يعني نمونه اي از بدن بيمار و همچنين قطعه‌اي از ژن اين ويروس که پرايمر نام دارد را به دستگاه مي دهيم. اگر حتي فقط 1 عدد از اين ويروس در نمونه بيمار باشد دستگاه از ژن آن ميلياردها کپي تهيه مي کند. سپس مي توان اين حجم زياد ژن را در صفحه فيلم فلورسنت حاصل از الکتروفورز مشاهده کرد. اگر باند هايDNA روي ژن ديده شد مطمئن مي شويم که بيمار ناقل اين ويروس است.

استفاده ديگر PCR در تشخيص بيماری سل می باشد. مايکوباکتريوم توبرکلوزيس يک باکتری بسيار کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمايشگاه حدود 20 روز طول می کشد. در PCR بيماری سل از نمونه ی خلط فرد بيمار به همراه پرايمرهايی که برای توالی خاص مايکوباکتريوم های مکمل می باشند، مورد استفاده قرار می گيرد. پس از انجام PCR قطعات DNA بدست آمده در مجاورت شناساگرهای اختصاصی برای سوش های مختلف مايکوباکتريوم ها قرار می گيرد و به اين صورت، گونه و سوش آن تشخيص داده می شود.

6- تحقیقات جنایی (forensic analysis)

در صحنه جرم، معمولا مقدار DNA بسیار کم است. بنابراین با روش PCR می توان تکثیر DNA را انجام داد تا مقادیر کافی از مولکول های ژنتیکی بدست آید. سپس ماهیت DNA بررسی می شود.

7- انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting)

با روش PCR می توان با توجه به ماهیت DNA به هویت اشخاص پی برد. بعنوان مثال والدین را شناسائی کرد و یا رابطه ژنتیکی افراد را بررسی نمود. همچنین رابطه تکاملی موجودات زنده نیز با روش انگشت نگاری ژنتیکی قابل مطالعه است.

8- بررسی DNA قدیمی (ancient DNA)

با روش PCR، مولکولهای DNA بسیار قدیمی حتی متعلق به ده ها هزار سال قبل مورد مطالعه قرار گرفته است. مثلا DNA یک ماموت از چهل هزار سال قبل، مومیایی های مصری و تزار روسیه با این تکنیک بررسی شده است.

9- جداسازی DNAی ژنومی

با روش PCR می توان بخش هایی از DNAی ژنومی را انتخاب و پس از جداسازی تکثیر نمود. مثلا برای کلونینگ DNA و یا تولید شاخص های دورگه سازی (hybridization probes) در روش های Southern و Northern، مقادیر زیادی از DNA مورد نیاز است که با روش PCR قابل تهیه است. همچنین در مواردی که حجم نمونه اولیه بسیار کم باشد، با روش PCR می توان DNAی موجود را تکثیر کرد و سپس مورد مطالعه قرار داد.

10- تعیین توالی DNA

پس از تکثیر DNA با روش PCR، می توان توالی نوکلئوتیدی را تعیین کرد و در صورت لزوم به پلاسمید باکتری یا DNAی کروموزومی در یوکاریوت ها الحاق نمود و بدین ترتیب DNA ی نوترکیب (recombinantDNA) ایجاد کرد. حتی در مرحله بعد می توان سریعا با استفاده از PCR، کلنی های باکتری را از نظر وجود این DNAی نوترکیب مورد بررسی قرار داد.

11-تعيين توالي های کروموزومی انسان در سلول های هيبريدی هتروکاريوتها

يکی از تکنيک های بررسی ژنوم انسان، تلفيق (هيبريد کردن) هسته های سلول های انسانی با سلول های حيوانات ديگر مثلاَ موش است. پس از انجام تلفيق دو هسته، کرومزوم های انسان به تدريج حذف می شوند، تا اينکه نهايتاَ يک کروموزوم در درون هسته هيبريدی باقی می ماند. حال گاهی به منظور بررسی های بيشتر لازم می شود که اين قسمت های ژنوم انسان تکثير شوند، مثلاَ وقتی که يک ژن خاص مورد بررسی قرار می گيرد. برای اين کار از نوع خاصیPCR  که به Alu-PCR معروف است استفاده می شود. در اين روش از پرايمرهايی استفاده می شود که مکمل توالي های بسيار تکراری ژنوم ها می باشد، اين توالی های 300 جفت بازی که گاهی تا 900000 بار در ژنوم انسان و ديگر پستانداران تکرار می شود را تکرارهای Alu می نامند. اين توالی ها بسيار متغير می باشند ولی در انسان قسمتی از اين توالی ها اختصاصی و ثابت است و به همين دليل به راحتی می توان از آن برای تکثير قطعات DNA که بين دو تکرار توالی Alu قرار دارند استفاده کرد. سپس اين DNA  را می توان خارج نمود و از نظر نوع پروتئين مورد سنتز و يا تعيين توالی و غيره مورد بررسی قرار داد. مهمترين استفاده روش فوق تعيين مکان ژنتيکی ژن های مختلف برروی کروموزوم های انسان است که تا قبل از اين روش تقريباَ ناممکن و يا بسيار مشکل بود.

12- بررسی پيوستگی ژن ها و تعيين فاصله ی بين ژن ها بر روی کرومزوم های انسان

در ژنتيک برای تعيين فاصله ی بين ژن ها از بررسی تعداد نوترکيب ها به نسبت فنوتيپ والدين استفاده می شود. اين روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسيار زياد و دوره ی رشد آن نيز کوتاه است به راحتی قابل انجام است؛ ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسيار محدود و با فاصله ی زمانی زياد می باشد، اين بررسی ها به سختی و با محدوديت بسيار انجام می گيرد. ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR  روش جديدی را برای اين کار پيدا کرده اند. برای اين کار از بررسی آلل های موجود در يک اسپرم استفاده می شود. از آنجائيکه اسپرم ها هاپلوئيد بوده و در هر اسپرم از هر کروموزوم يک عدد وجود دارد، با بررسی همزمان دو ژن بر روی يک کروموزوم و تعيين ميزان نوترکيبی بين اين دو ژن می توان فاصله ی ژنتيکی بين دو ژن را تعيين کرد. در واقع از نظر ژنتيکی بررسی 1000 اسپرم با بررسی 1000 فرزند يک خانواده برابر است. با استفاده از اين روش ثابت شده است که ميزان نوترکيبی کرومزوم ها در مردها با ميزان نوترکيبی در زن ها متفاوت است.

13- کلونینگ با PCR

قرار دادن جایگاه شناسایی آنزیم های برش دهنده در طرف 5` سکانس پرایمر: این روش مشکلاتی نیز دارد. این جایگاه ممکن است روی قطعه همانند سازی شده نیز وجود داشته باشد. استفاده از جایگاه دو آنزیم متفاوت در هضم اشکال ایجاد میکند که برای رفع این مشکل باید تعدادی باز به انتهای 5` پراپمر اضافه شود.

Blunt end ligation : برای اینکار دو انتهای قطعه همانند سازی شده باید Polish شود. این کار توسط آنزیم های کلنو و 4 DNA polymerase (پرکردن قسمت over hang) و یا آنزیم های S₁ nuclease و Mong bean nuclease انجام می شود.

T vector : پلاسمید ناقل را با آنزیم EcoRV ویا هر آنزیم دیگرکه DNA را بصورت Blunt برش میدهد هضم میکنند، سپس توسط آنزیم Terminal transferase یا آنزیم Taq poly تعدادی T به انتهاهای 3` رشته های پلاسمید خطی شده اضافه میکنند .( لازم به ذکراست که آنزیم Taq poly دارای خاصیت ترمینال ترانسفرازی است و تعدادی A به انتهای 3` محصول آمپلی فای شده اضافه میکند). با انجام واکنش Ligation پلاسمید و محصول PCR را بهم متصل میکنند.

تولید نیمه جایگاه شناسایی یک آنزیم برش دهنده در طرف 5` پرایمر. قطعات باT4 poly nucleotidkinase و ATP فسفریله میشوند و سپس بهم متصل میگردند، بعد توسط یک آنزیم هضم شده و کلونینگ انجام می گیرد.

کلون کردن محصول PCR به روش T-A cloning : پلاسمید با یک آنزیمی که DNA را بصورت blunt قطع میکند هضم می شود. سپس توسط آنزیم ترمینال ترانسفراز یا Taq پلیمراز و dTTP یک باز T به انتهاهای  OH- 3` آن اضافه میگردد. واکنش Ligation از این وکتور با محصول PCR که در انتهاهای OH- 3` آن باز A قرار دارد انجام می گیرد و پلاسمید در یک باکتری ترانسفرم می شود.