Gene cloning شامل مراحل زیر است :

1 – جدا کردن قطعه ژنی مد نظر از بقیه ژنها

2 – انتخاب وکتور مناسب

3 – اینتگره کردن ژن با وکتور و تشکیل پلاسمید کامل ( DNA Recambinant )

4 – انتقال پلاسمید به hust ( Transformation or Translection )

5 – تکثیر (Replication ) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلولهای دختری

6 –رونویسی (Tran script ion )

7 – ساخت پروتئین در فرایند ترجمه (Translation )

مثال : تولید انسولین توسط Ecoli : انسولین یک پروتئین یوکاریوتی است لذا ژن آنرا از سلول یوکاریوت ( Mamalian call ) جدا کرده و مراحل 1 تا 7 فوق را انجام می دهیم .(host همان Ecoli است که انسولین را می سازد ).

technology Recambinant تکنولوژی نوترکیبی :

منظور تولید موجودی نوترکیب است که به عنوان مثال در شیرش ماده ی دارویی TPAتولید میشود

آیا هر قطعه ژنی را می توان به منظور Tran script ion (رونویسی ) وارد سلول میزبان کرد ؟

یک قطعه ژنی بی سر و ته (!) یعنی بدون همراه داشتن سیگنال در داخل host خوانده نمی شود, بلکه باید یکسری سیگنالهایی را در قالب پسوند و پیشوند داشته باشد تا توسط سلول میزبان بتواند رونویسی شود .

ویژگی پلاسمیدها :

1 -     Indipended of the host cell chromosome خودبخودی و مجزا از کروموزوم اصلی دچار replication   (تکثیر ) شوند .

2 – اغلب ژنهای مقاوم به آنتی بیوتیک را به همراه دارند – به عنوان select marker به کار می رود .

به عنوان مثال : از پلاسمید پروکاریوتی و قطعه ژنی یک DNA نوترکیب ساخته ایم اینرا می خواهیم داخل Ecoli رها بکنیم یکسری آنرا می گیرند بقیه که اکثریت هستند پلاسمید را نمی گیرند برای جدا کردن این دو دسته از آنتی بیوتیکی در محیط کشت استفاده می شود آن دسته از   Ecoli ها که پلاسمید را گرفته اند به علت نداشتن ژن مقاوم به آنتی بیوتیک زنده می مانند و بقیه که نگرفته اند کشته می شوند.

3 – حداقل یک Original replication دارند که این شاخص ترین ویژگی پلاسمیدهاست .

مثال : پلاسمید IP 4 که به طور طبیعی در سلول پروکاریوتها است دارای ژنهای مقاوم به آمپی سیلین ، تتراسایکلین و کانامایسین است از همین ویژگی در select Marker استفاده می شود.

4 - تحمل( Campatibility):

پلاسمیدها Subtype های مختلف دارند و ممکن است به صورت همزمان و طبیعی چندین پلاسمید در داخل یک سلول پروکاریوتی حضور داشته باشد مثلاً بعضی از سویه های Ecoli تا 7 نوع پلاسمید مختلف را در خود جای داده اند .مهم این است که این پلاسمیدهانسبت به هدیگر Campatibility( تحمل) داشته باشند این تحمل, یک سیستم پیچیده ناشناخته است ولی ارتباط ویژه ای با Orginal replication مربوط به هر پلاسمید دارد .

- 5 سایز پلاسمیدها :

سایز پلاسمیدها ازKB 1تا KB250 ( Kilo base = kb ) بطور طبیعی متفاوت است برای کار بیوتیک ، پلاسمیدی مناسب است که زیر kb 10 باشد .

note  : هر kb برابر Base chain 1000 است

ویژگی وکتورها :

1 ) توانایی تکثیر داشته باشند . سلول میزبان مرتبط در حال تکثیر است ،اما پلاسمید نو ترکیب آن نتواند تکثیر شود در نتیجه در نسلهای بعدی (سلولهای دختر ) اثری از پلاسمید نخواهد بود لذا اولین و مهمترین ویژگی وکتورها و کلاً پلاسمیدهای نو ترکیبی توانایی تکثیر آنها در داخل سلول میزبان (host ) است .

2 ) داشتن اندازه مناسب برای وکتورها که همان اندازه ای کوچک است.

اگر اندازه پلاسمید بزرگ باشد مشکلاتی را به همراه دارد از جمله :

A :سخت شدن دستکاری ژنتیکی ( Gene manuculation ) روی آن

B : مشکل در ورود آن به host

C : مشکل در پروسه های مختلف مثل خالص سازی ( Plasmid purication ) و ...

مثلاً شکسته شدن در مراحل مختلف انجام کار روی آنها.

لذا باید سایز وکتور مناسب باشد این سایز مناسب در پلاسمید موجود در پروکارپوتها وجود دارد . پلاسمیدها هم سایزهای مختلف دارند یکسری خیلی کوچک هستند که از همان ژنهای tran script ion کد شونده توسط کروموزوم اصلی پروکارپوت ( در جلسه قبل گفته شده ) استفاده می کنند اما یکسری بزرگ هستند و ممکن است کدهایی را به همراه داشته باشند .

Copy number

تعداد پلاسمیدهای واحد ( از یک نوع ) که در یک زمان ( آنِ واحد ) در یک سلول پروکاریوتی وجود دارد . این تعداد از 15 ، 20 تا 1000 عدد متغیر است این ویژگی مرتبط با Orginal replcation[3] است هر چقدر Orginal repletion قوی تر باشد تمایل تکثیر پلاسمید بیشتر خواهد بود لذا تعداد پلاسمیدهای بیشتر خواهد شد.

ساخت وکتور (پلاسمید مصنوعی ) :

 در ساخت وکتورها ، پلاسمیدهای طبیعی پروکاریوتها را به عنوان پایه (base ) قرار داده و پلاسمیدهای مصنوعی را براساس آنها در آزمایشگاه Deve lope می کنیم یعنی با توجه به ویژگیهای مد نظر ، بخشهای مختلفی از پلاسمیدهای طبیعیِ مختلف را جدا کرده و به هم متصل کرده و پلاسمید مصنوعی را می سازند .

این وکتورهای مصنوعی باید خصوصیاتی را همراه داشته باشند :

1 – ژن خاص و مطلوب را داشته باشند.

2 – قابلیت Replication (تکثیر ) داشته باشند .

3 – خاصیت select ion Marker داشته باشند (مثلاً دارا ی ژن مقاوم به آنتی بیوتیک باشند )

4 – بتوانند در رونویسی Tran script ion و پروتئین سازی Translation پیش روند .

مثال : از اولین وکتورهای که Develope شده است می توان به PBR322 اشاره کرد :

BR: مشخص کننده آزمایشگاهی است که این Developing   در آن انجام شده است مثلاً 2 شخص (؟) و ( ؟ ) محقق اصلی آن بودند

322: شماره است که نشان می دهد پس از آن ژنهای مختلف دیگر مثل 325 ، Develope شده است

        P: پلاسمید                                      

این پلاسمید از نظر سایز مطلوب است و از جهت  select ion Marker هم دارای 2 ژن مقاوم به آمپی سیلین و تتراسایکلین است و هم اینکه high copy number  دارد .

با توجه به شکل پلاسمید PBR322 از سه پلاسمید طبیعی موجود در Ecoli ساخته شده است .

1 – ژن مقاوم به تتراسایکلین از پلاسمید R6-5

2 – ژن مقاوم آمپی سیلین از پلاسمید R1

3 – قسمت Orginal replication است از پلاسمید PMB1

(Tran script ion ) رونویسی پلاسمید سنتتیک :

پلاسمید مصنوعی باید قابلیت رونویسی شدن را داشته باشد در این منظور باید دارای سه جزء اصلی :

1 – Promoter

2– Terminator

3 – Ribosom binding site

 Promoter: 

ناحیه ای بین( 10 -و 35 -) است (یعنی اولین نوکئوتیدی که رونویسی می شود در این ناحیه حضور دارد ) این سکانسهای واحد ( Consenso cicuances ) در اکثر پروکاریوتها مشابه است تا RNA پلی مراز بتواند همه promoter ها را شناسایی کند . رونویسی از بعد از ناحیه promoter شروع می شود .

RNA پلی مراز با کمک Subunite سیگمای خود, promoter را می شناسد (ادامه دارد...)