آشنایی با سیستم الایزا ریدر ,

کاربرد میکروپلیت ریدر
ميکروپليت ريدر براي خواندن نتايج تست هاي الايزا مورد استفاده قرار مي گيرد. اين تکنيک کاربردي مستقيم در ايمنولوژي و سرولوژي دارد. از ميان کاربردهاي ديگر اين وسيله به تاييد حضور آنتي بادي ها يا آنتي ژن هاي يک عامل عفوني در يک ارگانيزم ، آنتي بادي هاي يک واکسن يا اتوآنتي بادي ها براي مثال در آرتريت
روماتوئيد مي توان اشاره کرد .
اصول کار
الايزا ريدر يک اسپکتروفتومتر اختصاصي است. بر خلاف اسپکتروفتومترهاي معمولي که قرائت جذب نوري را در گستره وسيعي از طول موج ها تسهيل مي کنند ، الايزا ريدر داراي فيلترها يا گريتينگ هاي انکساري بوده که گستره طول موج ها را محدود کرده و معمولا بين 044 تا 054 نانومتر عمل مي کنند. برخي از الايزا ريدرها در گستره ماوراء بنفش عمل کرده و قرائت را در محدوده 340 تا 044 نانومتر انجام مي دهند. سيستم نوري موجود در اين دستگاه ها توسط تعدادي از کارخانه ها با استفاده از فيبرهاي نوري به منظور تامين نور جهت چاهک هاي حاوي نمونه در ميکرو پليت طراحي مي شود. ابتدا يک شعاع نوري از نمونه اي که داراي قطري بين 1 تا 3 ميلي متر است عبور کرده و سپس يک سيستم آشکار کننده ، نور عبوري از نمونه را آشکار و تقويت مي کند . در مرحله بعد ، سيگنال مربوط به جذب نوري نمونه ها ثبت شده و سيستم خوانشگر نيز آن را به اطلاعاتي تبديل مي کند که سبب تفسير نتايج تست مي شوند. برخي از الايزا ريدرها با استفاده از سيستم هاي شعاعي نوري دوتايي کار مي کنند . نمونه هاي مورد آزمايش در پليت هايي که به اين منظور طراحي شده اند و داراي تعداد خاصي چاهک هستند ، قرار مي گيرند.
پليت هاي 8 ستوني همراه با 11 رديف که در مجموع 69 چاهک را تشکيل مي دهند ، رايج تر از بقيه هستند. براي کاربردهاي اختصاصي تر ، تعداد چاهک ها افزايش مي يابد که در برخي موارد تا پليت هاي 380 چاهکي را نيز شامل مي شود. افزايش تعداد چاهک ها به منظور کاهش مقدار مصرف معرف ها و نمونه ها است. موقعيت سنسور نوري الايزا ريدر بر اساس نوع کارخانه سازنده متغيير است ؛ به طوري که در برخي موارد ممکن است در بالاي پليت حاوي نمونه و گاهي نيز مستقيما در زير پليت قرار گيرد . امروزه ميکرو پليت ريدرها داراي کنترل هايي هستند که به وسيله ميکروپروسسورها تنظيم شده اند .
وسایل لازم جهت انجام تکنیک الایزا
جهت انجام آزمايش الايزا تجهيزات زير مورد نياز است : 1- الايزا ريدر 2- ميکرو پليت واشر )شستشو دهنده چاهک ها ) 3- سيستم توزيع کننده مايع )در اين مورد ممکن است از پيپت ها چند کاناله استفاده شود ) 4- انکوباتور
تجهیزات مورد نیاز در انجام تست های الایزا مراحل مکانيکي انجام تکنيک الايزا
يک تست اليزا به طور رايج شامل مراحل زير است : 1- شستشوي اوليه پليت که ممکن است با استفاده از ميکرو پليت واشر انجام شود . 2- استفاده از يک توزيع کننده مايع )ديسپنسر( يا پيپت چند کاناله . 3- پليت در انکوباتور قرار داده مي شود که داراي دماي کنترل شده بوده و واکنش ها در آن محل انجام مي شوند . 1 و 3 ممکن است چندين بار تکرار شوند تا اين که معرف هاي اضافه شده ، واکنش ها را کامل ، بسته به نوع تست ، مراحل 1 کنند . سرانجام وقتي تمام مراحل انکوباسيون کامل شد ، پليت به الايزا ريدر منتقل شده و سپس با قرائت جذب نوري نمونه ها ، نتيجه آن ها مشخص مي شود .
مراحل بیوشیمیایی تکنیک الیزا
1- چاهک هاي موجود در پليت با آنتي بادي ها و آنتي ژن ها پوشيده (Coat) مي شوند . 2- نمونه ها ، کنترل ها و استانداردها به چاهک ها اضافه شده و در دماي اتاق يا 30 درجه سانتيگراد براي يک مدت زماني معين ، طبق دستورالعمل تست انکوبه مي شوند. در طول انکوباسيون ، بسته به حضور يا عدم حضور و مقدار آنتي ژن يا آنتي بادي موجود در نمونه ، آنتي ژن نمونه به آنتي بادي کوت شده به پليت يا آنتي بادي موجود در نمونه به آنتي ژن Coat شده در پليت باند مي شود . 3- پس از انکوباسيون ، آنتي ژن ها يا آنتي بادي هاي آزاد ، شستشو داده شده و با استفاده از ميکرو پليت واشر و يک بافر شستشوي مناسب ، برداشته مي شوند . 4- در مرحله بعد ، يک آنتي بادي ثانويه به نام کونژوگه اضافه شده که حاوي آنزيمي است که به منظور ايجاد يک تغيير رنگي ، با يک سوبسترا واکنش خواهد داد . 5- سپس يک دوره زماني ثانويه از انکوباسيون شروع مي شود که در طي آن ، کونژوگه با کمپلکس آنتي ژن آنتي بادي در چاهک ها پيوند برقرار خواهد کرد - . 6- پس از انکوباسيون ، يک دوره شستشوي جديد انجام مي شود که سبب برداشت کونژوگه متصل نشده از چاهک ها خواهد شد . 7- در مرحله بعد ، سوبسترا اضافه مي شود. آنزيم با سوبسترا واکنش خواهد داد و سبب تغيير رنگ محلول خواهد شد. اين واکنش نشان خواهد داد که چه مقدار کمپلکس آنتي ژن آنتي بادي در پايان تست وجود خواهد داشت - . 8- وقتي که زمان انکوباسيون کامل مي شود، يک معرف براي توقف واکنش آنزيم - سوبسترا به آن اضافه شده که از تغييرات
بيشتر در شدت رنگ ايجاد شده، جلوگيري مي کند. اين معرف عموما يک اسيد رقيق است . 9- در پايان ، پليت بوسيله الايزا ريدر خوانده مي شود. نتايج حاصله براي تعيين مقادير اختصاصي يا حضور آنتي ژن ها يا آنتي بادي ها در نمونه به کار برده مي شوند . توجه : برخي از چاهک ها براي استانداردها و کنترل ها استفاده مي شوند. استانداردها براي تعريف نقاط cut-off به کار برده مي شوند . استانداردها و کنترل ها مقادير معيني هستند و براي اندازه گيري نتايج تست و ارزيابي اطلاعات در مقابل غلظت هاي مشخصي براي هر کنترل به کار برده مي شوند. فرايند توصيف شده در بالا عمومي است ؛ اگرچه بسياري از تست
هاي الايزا وجود دارند که همراه با مراحل يا متغيرهاي اختصاصي هستند .
نصب تجهیزات
به منظور عملکرد صحيح الايزا ريدر ، نکات زير لازم است تا رعايت شود : 1- يک محيط تميز و عاري از گرد و غبار 2- يک ميز کار ثابت و به دور از تجهيزاتي از قبيل سانتريفوژ ، شيکر و ... که سبب لرزش آن مي شوند. اين ميز بايد داراي اندازه مناسبي باشد ، به طوري که در کنار الايزا ريدر ، فضاي کاري مناسبي وجود داشته باشد. تجهيزات تکميلي مورد نياز براي انجام تکنيک توصيفي بالا عبارتند از: واشر ، انکوباتور ، ديسپنسر و کامپيوتر همراه با وسايل جانبي آن. 3- يک منبع تغذيه الکتريکي که سازگار با استانداردها و معيارهاي کشور باشد . در کشورهاي آمريکايي به طور مثال ، عموماً فرکانس هاي 94 هرتز و 114 ولت استفاده مي شود ؛ در حالي که در نواحي ديگر از جهان 114 تا 104 ولت و 54 تا 60 هرتز به کار برده مي شود .
کالیبراسیون الایزا ریدر
کاليبراسيون الايزا ريدر يک مرحله اختصاصي است که بايد توسط يک تکنسين يا مهندس آموزش ديده که به دستورالعمل هاي سازنده دستگاه آشنايي دارد ، انجام شود. براي انجام کاليبراسيون ، داشتن يک مجموعه از فيلترها که از لحاظ اندازه ، يکسان هستند ، الزامي است. سازندگان اين دستگاه ها ، پليت هاي کاليبراسيون را براي هر طول موجي که دستگاه به کار مي برد فراهم مي کنند . پليت هاي کاليبراسيون مجهز به حداقل سه مقدار جذب نوري از قبل تعيين شده )پايين ، متوسط و مقدار بالا( در دامنه اندازه گيري هستند .
براي انجام کاليبراسيون مراحل زير را بايد دنبال کرد : 1- پليت کاليبراسيون را روي دستگاه قرار دهيد . 2- يک خوانش کامل را با پليت کاليبراسيون انجام دهيد. مشخص کنيد که آيا تفاوت هايي در قرائت هاي به دست آمده از يک چاهک به چاهک ديگر وجود دارد يا خير. چنانچه اختلافي مشاهده شد ، پليت را به اندازه 184 درجه چرخانده و قرائت را مجددا تکرار کنيد تا از اختلافاتي که به خود پليت نسبت داده مي شوند ، جلوگيري کنيد. به طور کلي ، اگر نتايج پليت در دو طول موج
به ميزاني باشد که انتظار داريم ، گفته مي شود که دستگاه به کاليبراسيون ديگري احتياج ندارد . 3- تأييد کنيد آيا خوانشگر به کاليبراسيون احتياج دارد يا خير. چنانچه به کاليبراسيون احتياج دارد ، راهنمايي هاي رايج کارخانه سازنده دستگاه را براي کاليبراسيون دنبال کنيد. تأييد کنيد که خطي بودن (linearity) خوانشگر تا حد امکان قابل قبول است . 4- اگر دستگاه حاوي يک پليت کاليبراسيون نيست ، يک محلول رنگي را در چاهک هاي يک پليت از آن ريخته و فوري
نتايج را قرائت کنيد. سپس پليت را به اندازه 184 درجه چرخانده و دوباره قرائت را انجام دهيد. اگر هر دو خوانش ها و ميانگين مقادير در هر رديف يکسان هستند ، خوانشگر کاليبر است . 5- تاييد کنيد که خوانشگر به صورت ستون به ستون نيز کاليبر است. يک پليت تميز و خالي را در محل مخصوص قرار دهيد و
قرائت را انجام دهيد. اگر اختلافي بين هر يک از خوانش هاي ميانگين از اولين تا آخرين ستون وجود ندارد، مي توان فرض را بر اين گذاشت که خوانشگر کاليبر است .
حفظ و نگهداری رایج
الف( نگهداري اساسي )تکرار به صورت روزانه ) 1- مرور اينکه سنسورهاي نوري هر کانال تميز هستند. چنانچه کثيف هستند ، سطح پنجره هاي عبور دهنده نور و سنسورها را با يک برس کوچک تميز کنيد . 2- تأييد کنيد که سيستم نوري تميز است . 3- تأييد کنيد که کاليبراسيون خوانشگر کافي است. وقتي کارهاي روزانه شروع مي شود ، اجازه دهيد تا خوانشگر براي مدت 34 دقيقه گرم شود. در مرحله بعد ، قرائت Blank را انجام دهيد و سپس يک پليت کامل از سوبسترا را قرائت کنيد.
خوانش ها مي بايست يکسان باشند. اگر اين طور نبود ، پليت را چرخانده و قرائت را به منظور تعيين اين که آيا اختلاف در پليت يا در خوانشگر است ، تکرار کنيد. 4- سيستم کشنده اتوماتيک اسلايدها (Automatic drawer sliding system) را بررسي کنيد که بايد نرم و ثابت باشد .
ب( نگهداري بازدارنده )تکرار هر سه ماه يکبار ) 1- پايداري لامپ را تأييد کنيد. پليت کاليبراسيون را به کار برده ، قرائت را با فاصله 34 دقيقه مجدداً با همان
پليت انجام دهيد . قرائت ها را مقايسه کنيد که هيچ تفاوتي نبايد ميان آن ها مشاهده شود . 2- سيستم نوري دتکتور و سيستم هاي نوري را تميز کنيد . 3- کشنده پليت (Plate drawer) را تميز کنيد . 4- مکان قرار گيري هر چاهک را با استفاده از سيستم هاي انتشار نور و آشکارکننده تأييد کنيد . ELISA مخفف عبارت Enzyme-Linked Immunosorbent Assay یک روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده با حساسیت بسیار بالا است که امکان آنالیز تعداد زیادی نمونه را به صورت همزمان فراهم می کند. این روش در ایمونولوژی )ایمنی شناسی( برای تشخیص وجود یک آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه مورد آزمایش استفاده می شود که عموما به عنوان ابزاری تشخیصی در پزشکی و پاتولوژی و همچنین تست کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع کاربرد دارد .
ELISA
بر پايه اندازه گيری کمپلکس رنگی آنتی ژن و آنتی بادی استوار است. به اين ترتيب که نمونه مورد آزمايش با مقدار نامشخصی آنتی ژن روی فاز جامد )معمولا پليت پلی استيرن( ريخته می شود، سپس آنتی بادی بازيابی اضافه می شود تا با آنتی ژن واکنش داده و ترکيبی ايجاد کند . آنتی بادی بازيابی با آنزيم پيوندی کووالانسی برقرار می کند. بين هر مرحله پليت با محلول پاک کننده ملايمی شسته می شود تا هر پروتئين يا آنتی بادی باقيمانده شسته شود. پيش از آخرين مرحله شستشو، پليت با اضافه کردن زير لايه آنزيمی کشت داده می شود و ماده رنگی توليد می شود. طول موج رنگ به دست آمده توسط يک دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شده و ثبت می شود که اين طول موج معرف حضور يک آنتی بادی يا آنتی ژن و نيز غلظت آن است. در ELISA های قديمی تر زيرلايه رنگ زا به کار گرفته می شد در حاليکه در تست های جديدتر زيرلايه های فلوروژنيک با حساسيت بسيار بالاتر مورد استفاده قرار می گيرد . امروزه ELISA يکی از قدرتمند ترين روش های آزمايشگاهی برای پی بردن به اختلالات سيستم ايمنی است، اين تست به منظور پی بردن به آنتی ژن ناشی از ارگانی عفونی در بدن يا مواد غير نرمالی که معرف برخی بيماری ها است انجام می شود . همچنين آنتی بادی هايی که در پاسخ به برخی عفونت ها يا بيماری ها به وجود آمده نيز توسط اين تست قابل تشخيص هستند. تست ELISA اولين آزمايش متداول در غربال زنی HIV است. در تست ELISA سرم فرد 044 بار رقيق شده و به صفحه ای که حاوی آنتی ژن HIV است اضافه می شود. اگر آنتی بادی HIV در سرم وجود داشته باشد، به اين آنتی ژن های HIV می چسبد. سپس به منظور از بين بردن ديگر اجزا سرم، پليت شستشو داده می شود. يک "آنتی بادی ثانويه" ساخته شده مخصوص )يک آنتی بادی چسبيده به آنتی بادی ديگری( به پليت اعمال شده و شستشوی ديگری انجام می شود. اين آنتی بادی ثانويه به صورت شيميايی به آنزيم از پيش تهيه شده می چسبد. اين بار زير لايه ای برای آنزيم اعمال شده و توسط آنزيم کاتاليز می شود که منجر به تغيير رنگ در فلورسانس می شود . نتايج ELISA به صورت عددی گزارش می شود. بحث انگيزترين وجه اين تست تعيين نقطه برش بين نتايج مثبت و منفی است . علاوه بر آزمايش HIV از ELISA برای آزمايش بيماری هايی چون هپاتيت، تب استخوان شکن، leptospirosis ، عفونت انگلی،
تبخال، سرخجه و ديگر عفونت های ويروسی و باکتريايی استفاده می شود . پيش از پيدايش روش ELISA ، تنها گزينه برای انجام سنجش ايمنی، ايمنی سنجی راديويی بود، که از آنتی ژن ها و آنتی بادی هايی که به صورت راديواکتيو مميز شده بودند استفاده می شد. در اين روش در صورت وجود آنتی بادی يا آنتی ژنی خاص، راديواکتيويته سيگنالی توليد می کرد. تئوری روش ايمنی سنجی راديويی اولين بار سال 1694 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجايی که راديواکتيويته خطرات زيستی داشت، پيشنهاد امن تر و ايمن تری مبنی بر جايگزينی سيگنال های غير راديو اکتيو به جای سيگنال های راديو اکتيو ارائه شد. وقتی يک آنزيم مشخص )مانند پر اکسيداز( با زير لايه مناسب واکنش می دهد، منجر به تغيير رنگ آن می شود که می تواند به عنوان سيگنال استفاده شود. البته بايد تناسب بين سيگنال و وجود آنتی بادی يا آنتی ژن تعيين می شد که اين پروسه توسط Stratis Avrameas و G.B. Pierce
انجام شد. در سال 1699 توسط Wide و Porath اين روش تکميل تر شد. و در سال 1601 Peter Perlmann و Eva Engvall نهايتا به روش ELISA به شيوه امروزی دست پيدا کردند . ELISA امروزی مزايای زيادی نسبت به روش های ايمنی سنجی راديويی دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امکان اتوماسيون، امکان افزايش حساسيت روش، عمر طولانی کيت های آنزيمی، سرعت خوانش بالا و قيمت ارزان تر دستگاه ها و معرف ها . تست ELISA با روش های گوناگونی انجام می شود که که به صورت کلی به دو دسته ELISA مستقيم و غير مستقيم تقسيم بندی می شود. در روش مستقيم آنتی ژن يا آنتی بادی مورد نظر به طور مستقيم بر سطح فاز جامد پوشش داده می شود و سپس آنتی بادی يا آنتی ژن مکمل نشاندار شده آن به سيستم اضافه می شود. با آناليز سيگنال توليد شده می توان پی به وجود آنتی ژن يا آنتی بادی مورد نظر در نمونه برد. اين روش ارزش تشخيصی چندانی نداشته و بيشتر کاربرد تحقيقاتی دارد . در روش غير مستقيم سرم رقيق شده به آنتی ژن های پوشش داده شده در فاز جامد اضافه می شود، سپس نمونه را به آن اضافه کرده و پس از گذشت زمان انکوباسيون و يک مرحله شستشو، آنتی هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهک اضافه می شود. اين روش برای تعيين آنتی بادی اختصاصی يا تيتراسيون آنتی بادی در سرم استفاده می شود . روش های ELISA ساندويچ و ELISA رقابتی يا مهاری از ديگر انواع متداول اين تکنيک هستند. روش ساندويچ که متداول ترين روش ELISA است، يک آنتی ژن در بين دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گيرد. روش های رقابتی نيز بر پايه رقابت دو آنتی ژن يا دو آنتی بادی برای اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه کردن هردو آناليت به سيستم همزمان انجام شود،
روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يک دوره زمانی انکوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری می نامند . مراحل انجام يک آزمون ELISA که تقريبا در تمام انواع آن مشترک است عبارت است از : 1) پوشش دهی، که به معنی جذب يک آنتی ژن يا آنتی بادی با سطوح جامد است . 2) اضافه کردن نمونه های مورد آزمايش . 3) گذشت مدت زمان کافی برای انجام واکنش که به اصطلاح انکوباسيون واکنشگرها ناميده می شود . 4) انجام عمل شستشو توسط واشر ELISA ، به منظورجدا کردن واکنشگرهای متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهای آزاد و متصل نشده . 5) اضافه عوامل لينک شده با آنزيم . 6) مجددا طی مدت زمان انکوباسيون برای واکنشگرها . 7) استفاده مجدد از واشر ELISA جهت انجام عمل شستشو . 8) افزودن زيرلايه آنزيم جهت تشخيص واکنش دهنده ها . 9) طی زمان انکوباسيون . 10) اتمام واکنش آنزيمی توسط متوقف کننده ها و خوانش دانسيته نوری به دست آمده توسط خواننده .ELISA برای انجام تست ELISA بايد نمونه خون از بيمار گرفته شود و سرم آن جدا شود . برای اين کار بايد به مواردی دقت داشت. مثلا از بستن گارو برای مدتی طولانی بايد اجتناب کرد چرا که ممکن است در پارامترهای مورد اندازه گيری تاثير گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازی سرم نيز بايد دقت شود که فيبرينوژن يا ذرات ديگر نباشد. پيش از انجام آزمايش بايد به کيفيت کيت های مورد مصرف توجه کرد، همچنين نگهداری آن ها بايد در دمای C 8-2 صورت گيرد . تمامی محلول های موجود در کيت قبل از مصرف بايدخوب مخلوط شده و به دمای آزمايشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزايش پايداری، بلافاصله اجزاء کيت به يخچال منتقل شود. درحين انجام آزمايش بايد از نوسانات غير تدريجی دما در هنگام انکوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگيری کرد. ايجاد پديده هوک باعث ايجاد نتايج پايين کاذب می شود لذا توصيه می شود برای جلوگيری از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم يک دهم رقيق شده، مخلوط وآزمايش را انجام دهيم، تا اثر احتمالی هوک اصلاح شود. از آنجا که فريز و ديفريز کردن نمونه ها باعث کاهش سطح برخی از هورمون ها می شود، بايد تا حد ممکن از اين کار پرهيز شود. پيش از اندازه گيری بايد کليه ابزارهای مورد استفاده اعم از نوک ابزار نمونه گيری و کيت ها استريل شوند. که البته استفاده از ابزارهای يکبار مصرف پيشنهاد می شود و بايد قبل از استفاده لوله آزمايش های شيشه ای آن ها را با اسيد سولفوريک رقيق شستشو داده و با آب مقطری که دوبار تقطير شده آبکشی انجام داد. از به کار بردن محلول های شستشوی نامناسب يا آب مقطر ناخالص بايد پرهيز کرد. ضمنا بايد از کارکرد صحيح دستگاه ها و تجهيزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فيلترهای خواننده ELISA به کمک استفاده از ماده رنگی با ثبات، نظير بيکرومات پتاسيم يا عملکردصحيح دستگاه واشر ELISA اطمينان حاصل کرد . شیکر ELISA SHAKER) ELISA) تکان دادن ميکروپليت ها )shaking( از مهم ترين بخش های تکنيک ELISA است، چرا که تاثير زيادی در تغيير رنگ محيط آنزيمی پس از افزودن محلول اسيدی دارد . استفاده از روتاتور معمولی با قطر چرخش زياد و تعداد دور کم و در نتيجه تکان دادن آهسته ميکروپليت ها باعث خوب مخلوط نشدن معرف ها و در نتيجه ادامه و پيشرفت جزئی واکنش در طی زمان و به روز
خطا می شود. همچنين تکان شديد اين پليت ها نيز باعث آلوده شدن چاهک های ميکرو پليت با هم می شود . شيکر ELISA دستگاهی است که برای مخلوط کردن محتويات ميکروپليت ها به کار گرفته می شود. شيکر ELISA با حرکت سريع با قطر چرخش کم باعث اختلاط مناسب معرف ها و در نتيجه پيشرفت واکنش در طی زمان می شود. شيکرهای امروزی مجهز به سيستم کنترل زمان و کنترل دور به صورت ديجيتال است . واشر ELISA washer)ELISA) از ديگر مراحل مهم تست ELISA ، شستشو است که در هر مرحله از تست به منظور دفع و تخليه کامل مولکول های غير
اختصاصی از محيط واکنش انجام می گيرد. شستشو به دو صورت دستی و خودکار انجام می شود. ابتدايی ترين روش شستشو،
شستشوی دستی است بدين ترتيب که مايع شستشو را با پيپت بر روی چاهک ها ريخته و سپس آن را در سينک خالی می کنند.
فشار بالای شستشو در روش دستی که به علت تخليه سريع بافر به وجود ميآيد، منجر به جداشدن و حذف اتصالات اختصاصی
از کف چاهک ها و کاهش کاذب می شود، همچنين فشار پائين شست شو ناشی از تخليه آهسته بافر، باعث عدم دفع کامل اتصالات
غير اختصاصی و افزايش کاذب جذب نوری می شود. بهتر است در روش دستی تا نزديک لبه فوقانی چاهک ها از محلول
شستشو پر شود، در صورت پر شدن لب به لب چاهک ها، احتمال آلودگی چاهک به چاهک افزايش پيدا می کند. همچنين بايد از
سرريز شدن محلول شستشو، ايجاد حباب هوا در چاهک ها و تماس با کف چاهک جلوگيری کرد. در هنگام تخليه چاهک ها نيز
بايد مکش و تخليه به طور کامل انجام شده و دقت شود که حتی ذره ای از مايع بافر در کف چاهک ها باقی نماند. اما اين روش
شستشو )شستشوی دستی( بسيار وقت گير بوده و خطر آلودگی محيط و کاربر را در پی دارد. از اين رو دستگاه های خودکار
واشر ELISA برای شستشوی پليت ها به وجود آمده است که علاوه بر دقت و ايمنی بالاتر، سريع تر و راحت تر عمل شستشو را
انجام می دهند. اين دستگاه ها در انواع مختلف 8 يا 11 کاناله، تک سوزنه و دوسوزنه موجود است . در انواع دو سوزنه، يک
سوزن برای ريختن و ديگری برای خالی کردن محلول شستشو استفاده می شود بدين ترتيب که يک سوزن به طور دائم در حال
مکش است تا اگر مايع شوينده بيشتری در هنگام پر کردن وارد چاهک ها شد ، آن را خالی کند و اين در حالی است که در مدل
تک سوزنه تمامی اقدامات توسط همان يک سوزن صورت می گيرد . خواننده ELISA reader) ELISA) خواننده ELISA در واقع يک دستگاه فتومتر است که در آخرين بخش از تست ELISA به طور اختصاصی برای خواندن نمونه
های مربوطه طراحی شده است. وظيفه آن طيف سنجی نوری يا خوانش دانسيته نوری واکنش ELISA است. طول موج مشخصی
از نور از پائين درون چاهک می گذرد، در مسير آن فيلتر مناسبی باتوجه به نوع آنزيم و نوع سوبسترای آنزيم جهت دستيابی به
طول موج مطلوب قرار داده می شود. در بسياری از خوانشگرها سيستم تک موج يا دو موج است و جهت برطرف سازی نقص
سيستم نوری ، تغييرات چاهک به چاهک حجم نهايی در چاهک ها، تصحيح جذب نوری به طور خودکار صورت می گيرد .
اين عمل توسط نوع خاصی از فيلترتحت عنوان فيلترهای تفاضلی صورت می گيرد. خوانش ميزان جذب محتوی چاهک ها
توسط خواننده ELISA الزاما بايستی در زمان تعيين شده انجام شود. بعضی از دستگاه های خواننده ELISA قابليت برنامه ريزی
زمانی، نوع تشخيص و کنترل و در نهايت مشخص کردن مثبت يا منفی بودن نمونه های مجهول را دارا هستند . امروزه انواع مختلفی از خوانشگرها برای پليت ها ی ELISA در بازار موجود هستند اکثر اين خوانشگرها يک ستونی يا 69
خانه )يک پليتی( بوده که اکثرا خودکار و تعداد اندکی نيز دستی هستند. اين دستگاه ها دارای فيبرهای نوری هستند. در
دستگاه های خواننده انتخاب طول موج توسط فيلترها يا گريدها )گريتينک ساختارهايی که با تابيده شدن نور به آن ها، تنها نور با
طول موج خاصی ازآن ها ساطع می شود( انجام می شود. برای چاپ نتايج نمونه های موردآزمايش ، يا دستگاه خود دارای پرينتر
است يا می توان آن را به پرينتری متصل کرد . همچنين می توان جهت انجام محاسبات بيشتر خواننده ELISA را به کامپيوتر وصل
کرد .
روش کار الايزا کيت های الايزا الايزا چيست سنجش امين کيتهای الايزا نحوه تست الايزا الايزا------ -A ELIS- شيوه های الايزا -Sandwich ELISA
ست الايزا را در حالت معمول برای رديابی آنتی ژن يا آنتی بادی بکار می برند بدين ترتيب که يکی از اين دو ماده در بستر
جامد ثابت می شود و برای رديابی دومی بکار گرفته می شود، اما اساسا برای رديابی هر جفت ماده ای که مثل جفت آنتی ژن و
آنتی بادی به هم گرايش داشته و قدرت اتصال مناسبی نسبت به هم دارند ميتواند بکار گرفته شود )مثلا لکتين به ليگاند مربوطه
اش يا مولکول به گيرنده اختصاصی اش( البته اين پديده يعنی اتصال بين دو ماده ای که آنتی بادی و آنتی ژن نيستند اما گرايش
به هم دارند اغلب اوقات مشکل آفرين است و برای بالا بردن حساسيت و اختصاصيت اتصال بين آنتی بادی و آنتی ژن در الايزا
بايد اين اتصالات ناخواسته را به طريقی مهار کرده و يا کارهای جبرانی لازم را در نظر گرفت . 1 ) تست اليزا برای جستجوی
آنتی ژن : ELISA روش بسيار حساسی است که )معمولا( برای جستجوی آنتی ژن يا آنتی بادی بکار ميرود در تحت شرايط تنظيم
شده )از نظر غلظت يونی و pH) پروتئين ها ( آنتی ژن يا آنتی بادی( به طور خودبخود تمايل دارند که به بستر جامد )در اين
تست plate هايی از جنس پلی استيرن( متصل شوند، ماهيت اين اتصال بخوبی معلوم نشده است اما برگشت پذير بوده و با
استفاده از pH های بالاتر يا پايين تر و استفاده از غلظت های يونی بالا اتصال قطع ميشود اين نوع اتصال خودبخودی اگر چه
ظرفيت محدودی دارد ولی با بکارگيری سيستم های تقويتی مناسبی مثل سيستم آنزيم سوبسترا اين اتصالات وسيله بسيار خوبی -
برای طراحی سيستم الايزا گرديده است . برای انجام الايزا : 1 ) ابتدا بايد پروتئين مورد نظر را به کف پليت چسباند . 2 ) نقاط
اتصال باقی مانده را بايد با محلول پروتئينی مناسب مسدود کرد . 3 ) محلول مورد آزمايش را اضافه کرد تا دو ماده همديگر را
پيدا کرده و متصل شوند 4 ) سيستم های تقويتی اوليه را برای افزايش حساسيت آزمايش بکار گرفت 5 ) سيستم آنزيمی نهايی را
به راه انداخته و رنگ نهايی توليد شده را اندازه گرفت حال اين 5 مرحله به تفکيک توضيح داده می شوند : 1 ) اتصال پروتئين به
کف پليت (Coating): آنتی ژن )يا آنتی بادی( در مقاديری در حدود ميکروگرم به داخل چاهک پليت الايزا اضافه شده و فرصت
داده ميشود تا به مقدار کافی به کف چاهک (well) متصل شود برای اينکار بسته به نوع پروتئين بافرهای مختلفی به کار گرفته
می شود و غلظت پروتئين نيز بايد مناسب سازی شود در مقادير بسيار پايين حساسيت رديابی پايين می آيد و در مقادير بالای
آنتی ژن اتصالات سستی نيز برقرار ميشود که در مراحل بعدی کنده شده و هنگام شستشو آنتی ژن همراه با آنتی بادی
اختصاصی دفع می شوند و لذا حساسيت تست مجددا پايين می آيد . بطور کلی اين مرحله اساسی بوده و نقش زيادی در نتيجه
نهايی دارد ايده آل های مورد انتظار برای اين مرحله اينها هستند : الف( مقدار آنتی ژن متصل شده به کف همه چاهک های يک
پليت بايد يکنواخت باشند و کمترين واريانس را در نتيجه ايجاد کنند، بدين معنی که وقتی يک نمونه واحد را در چند چاهک مختلف
منتقل نموده و آزمايش کنيم بايد نتايج بدست آمده به هم نزديک بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنين اگر آزمايش مورد نظر
در حجم بالا انجام ميگيرد و چند پليت را هم زمان کوت نموده و استفاده ميکنيم بايد جنس پليت ها و شرکت تهيه کننده آنها يکسان
باشد تا از خطای مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پليت ها جلوگيری شود و ترجيحا بافر کوتينگ و زمان کوتينگ و محلول
آنتی ژنی آماده شده برای کوتينگ بهتر است يکسان باشند . ب( اتصالات برقرار شده بين آنتی ژن و بستر جامد بايد به اندازه
کافی محکم و قوی باشند تا در مراحل شستشوی بعدی کنده نشوند، معمولا برای آنتی ژن های عادی، اتصال دهنده اضافی لازم
نيست ولی اگر آنتی ژنی استثنائاً با روش معمول به کف پليت نچسبيد يا اتصالات سستی برقرار کرد از مواد و روش های
خاصی برای اتصال آنتی ژن به کف بستر استفاده می شود )مثلاً استفاده از گلوتارآلدئيد يا اشعه ايکس يا ...). ج( پروتئين متصل
شده نبايد آنقدر کم باشد که نتواند مقادير بالای آنتی بادی را جذب کند در اين صورت غلظت های بالای آنتی بادی قابل تشخيص
نخواهد بود از طرفی پروتئين متصل شده نبايد آنقدر زياد باشد که اتصالات غيراختصاصی از اتصالات اختصاصی بيشتر شوند
که در اين صورت جواب آزمايش قابل اغتماد نخواهد بود برای تامين اين سه هدف تمهيدات خاصی به کار گرفته می شوند که
در فرصتی مناسب توضيح داده خواهند شد 2 ) مرحله مسدود سازی يا بلوکينگ (blocking): نقاطی از کف پليت که با پروتئين
اختصاصی پوشانده نشده اند با استفاده از محلول های پروتئينی خنثی )از اين نظر که در واکنش اختصاصی بعدی اثر سوئی
ندارد( پوشانده می شوند محلول های پروتئينی برای اين منظور حاوی شير کم چربی يا آلبومين گاوی يا ژلاتين و يا کازئين
ميباشند. علاوه بر پروتئين از دترژانت های غير يونی خاصی نظير Tween 20 يا Tween 80 يا ... نيز به عنوان کمکی
استفاده می شوند نوع اين مواد و مقادير بکار برده شده به صورت تجربی تعيين می شوند و با توجه به تجربيات ديگران می توان
محدوده خاصی را برای کار مورد نظر امتحان کرد و بهترين غلظت را بدست آورد )چون پروتئين ها از ريشه های جانبی
متفاوتی برخوردارند لذا برای پروتئين های بسيار خالص مثل پروتئين های ريکامبينانت مناسب سازی اين ترکيبات در بالا بردن
اعتبار نتايج بسيار کمک کننده خواهد بود(. علاوه بر پروتئين و دترژانت، غلظت يونی بافر بلوک کننده نيز اهميت زيادی دارد و
برای اتصال انتخابی پروتئين مورد نظر (از ميان مخلوط پروتئينی( ميتوان بافرهای مختلف و غلظت يونی متفاوت را ارزيابی
کرده و بهترين بافر را برای آزمايش مورد نظر بدست آورد . 3 ) اتصال آنتی ژن و آنتی بادی محلول مورد آزمايش که احتمال
ميرود حاوی مقادير قابل رديابی از آنتی بادی بر عليه آنتی ژن اختصاصی موجود در کف پليت ميباشد در اين مرحله در بافر
مناسبی تهيه شده و اضافه می شود آنتی بادی شناور در محلول، آنتی ژن متصل به بستر را پيدا کرده و به آن متصل می شود
بندرت اين آنتی بادی متصل به آنزيم است اما در اغلب اوقات کونژوگه آنزيمدار در مرحله بعدی بکار گرفته می شود . آنتی بادی
های متصل نشده با عمل شستشو از محيط حذف می شوند بافر شستشو معمولا دارای پروتئين خنثی به کار گرفته شده در محلول
بلوکان است. چرا؟ حاوی دترژانت ميباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافری مناسب برای اتصال آنتی ژن با آنتی بادی است.
آنتی بادی ها، سرم ، و محلولهای بکار گرفته شده در مراحل مختلف الايزا معمولا در بافر شستشو رقيق می شوند . 4 ) سيستم
های تقويتی اوليه سيستم تقويتی اوليه قبل از سيستم تقويتی اصلی )که همانا بکار گرفتن خصوصيت آنزيمهاست( ميباشد در اين
مرحله ما واکنش های اضافه تری را به کار ميگيريم تا قدرت اندازه گيری تست )حساسيت و اختصاصيت( بالا برده شود . بدين
منظور از قدرت تقويت کنندگی بيوتين آويدين، بيوتين استرپتاويدين، لکتين ليگاند و ... استفاده می شود--- . 5 ) تقويت آنزيمی هر
آنزيمی بر روی سوبسترای اختصاصی خود اثر کرده و آنرا به محصول تبديل می کند اين واکنش در طی زمان منجر به جمع
شدن مقدار متنابهی از محصول در محيط می شود بدين معنی که با گذشت زمان معينی يک مولکول آنزيم می تواند مولکول های
سوبسترای بسياری را به محصول تبديل کند اين اثر افزايشی در حقيقت اساس الايزا را تشکيل ميدهد. بدين ترتيب که آنتی بادی
نهايی باقی مانده پس از شستشوی نهايی با مولکول آنزيم متصل است و افزودن سوبسترا در طی زمان معينی (مثلاً يک ساعت(
منجر به آزاد سازی مقادير متنابهی سوبسترا می گردد که يا خود رنگی ميباشد يا در واکنش با ماده ديگری (کروموژن يا رنگزا(
که به محيط اضافه شده است رنگ توليد ميکند در نهايت رنگ توليد شده توسط دستگاه قرائت کننده مخصوصی خوانده شده و
محاسبات لازم بر روی داده های بدست آمده انجام می گيرد اساس تست Sandwich ELISA برای اندازه گيری سيتوکين در
روش الايزای ساندويچی مولکول اندازه گيری شده در واقع در بين دو مولکول مختلف آنتی بادی قرار ميگيرد )ساندويچ ميشود(
مثلا اين روش را در مورد اندازه گيری سايتوکاين اينترفرون گاما شرح ميدهيم : اساس( سلول های طحالی گرفته شده از موش
های دريافت کننده واکسن در اثر تحريک با آنتی ژن اختصاصی در محيط کشت تکثير پيدا خواهند کرد برای تعيين اينکه غالب
سلول های تکثير يابنده از نوع Th1 هستند يا Th2 بايد پروفيل سيتوکينی در محيط کشت مشخص شود بدين منظور تعيين مقدار
سيتوکين های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محيط کشت مد نظر قرار ميگيرد . چنانکه در شکل زير مشخص شده
است در اين روش آنتی بادی منوکلونال ضد آنتی ژن به کف plate چسبانده ميشود سپس فرصت داده ميشود تا آنتی ژن )در اين
تحقيق سيتوکين IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتی بادی پلی کلونال ضد آنتی ژن اضافه ميشود که متصل به
آنزيم پراکسيداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ايجاد محصول رنگی ميشود که توسط دستگاه
ELISA Reader قرائت ميگردد چون در اين روش آنتی ژن در بين دو آنتی بادی قرار ميگيرد لذا به ساندويچ مشهور شده است .
: اساس و انواع روشهای الایزا
اساس واکنش :
الایزای غیر مستقیم :
برای تعيين آنتی بادی اختصاصی و يا تيتراسيون آنتی بادی در نمونه های سرمی استفاده می شود .
در واکنش اين سيستم آنتی ژن به جدار چاهک ها )از جنس پلی استيرن( متصل شده (کوت می شود(. سپس نمونه حاوی آنتی
بادی به چاهک ها اضافه می شود. پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسيون شستشو انجام شده و سپس آنتی هيومن
گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهک اضافه می شود. )بر حسب اينکه چه کلاسی از آنتی بادی برای اندازه گيری اهميت دارد
نوع آنتی هيومن مورد استفاده نيز متفاوت است مثلأ برای IgG از آنتی هيومن IgG استفاده می شود ).
اختصاصيت روش بستگی به آنتی ژن کوت شده در چاهک ها دارد .
برای جلوگيری از جذب غير اختصاصی پروتئين های موجود در سرم و جلوگيری از اشغال نقاط اتصال آنتی ژن نمونه بوسيله
بافر رقيق کننده نمونه (Sample Diluent) رقيق شود .
الایزای ساندویچ :
اين روش خود به دو دسته تقسيم می شود :
الف( روش Ag Capture یا Ab Sandwich
شايعترين روش الايزا بوده و يک آنتی ژن )که بايد دو ناحيه آنتی ژنيک متفاوت داشته باشد مثل TSH, LH, FSH, PSA و hCG)
بين دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گيرد. يک آنتی بادی برای به دام انداختن آنتی ژن به چاهک کوت می شود و آنتی بادی
دوم که با آنزيم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل می کند .
ب( روش Antibody Capture
اين روش خود به دو دسته تقسيم می شود :
1) روش Direct Ab Capture یا Ag Sandwich
در اين روش از آنتی ژن کوت شده برای به دام انداختن يک آنتی بادی اختصاصی استفاده می شود. سپس آنتی ژن نشاندار به
آنزيم به محيط اضافه شده و از طريق بازوی ديگر آنتی بادی (Fab) به آن متصل می شود. در نتيجه آنتی بادی اختصاصی در
.(HBs Ab) بين دو آنتی ژن ساندويچ می شود مثل کيت
2) روش Indirect Ab Capture یا Indirect Ag Sandwich
آنتی هيومن گلوبولين به چاهک کوت شده و با اضافه کردن نمونه آنتی بادی به دام می افتد و سپس با اضافه کردن آنتی ژن
اختصاصی به محيط يک کمپلکس ايمنی تشکيل می شود. سپس آنتی بادی اختصاصی نشاندار بر عليه آنتی ژن به عنوان سيستم
شناساگر استفاده می شود .
الایزای رقابتی یا مهاری :
در روش های فوق اساس سنجش بر رقابت بين دو آنتی بادی يا دو آنتی ژن )که يکی نشاندار است( است .
روش رقابتی: هر دو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه می شود .
روش مهاری يا بلاکينگ: ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يک دوره انکوباسيون آناليت نشاندار اضافه می گردد .
الف ) الایزای رقابتی یا مهاری برای آنتی ژن :
آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به يک آنتی بادی اختصاصی کوت شده در چاهک با هم رقابت کرده.
منحنی اين روش به صورت معکوس است، بدين معنی که آناليت نشاندار در حضور مقادير زياد آناليت غيرنشاندار موجود در
نمونه کمتر به آنتی بادی متصل می شود. روش کمی لومينسانس استفاده می شود .
ب ) الایزای رقابتی یا مهاری برای آنتی ژن :
آنتی بادی نشاندار و آنتی بادی موجود در نمونه برای اتصال به يک آنتی ژن کوت شده در چاهک با هم رقابت کرده. منحنی اين
روش به صورت معکوس است، بدين معنی که آناليت نشاندار در حضور مقادير زياد آناليت غيرنشاندار موجود در نمونه کمتر
به آنتی می باشد HBc Ab بادی متصل می شود. شاخصترين مثال برای اين روش تست
مراحل یک آزمون الایزا
مراحل انجام يک آزمون الايزا به صورت زير مي باشد
1( جذب يک آنتي ژن يا آنتي بادي به سطوح جامد پلاستيکي که اصطلاحا پوشش دهي ناميده مي شود
1( افزودن نمونه هاي مورد آزمايش
3( انکوباسيون واکنشگرها براي دراختياز قراردادن مدت زمان کافي براي انجام واکنش
4( جدا نمودن واکنشگرهاي متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو
5( افزودن عوامل متصل شده با آنزيم
6( انکوباسيون واکنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان کافي براي انجام واکنش
0( جدا نمودن واکنشگرهاي متصل شده و واکنش داده از واکنشگرهاي آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو
8( افزودن سوبستراي آنزيم جهت تشخيص واکنش دهنده ها
6( انکوباسيون واکنشگرها براي دراختيار قراردادن مدت زمان کافي براي انجام واکنش
14 ( خاتمه دادن واکنش آنزيمي توسط متوقف کننده ها و قرائت دانسيتة نوري بدست آمده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر
شرح مراحل فوق در ادامه آمده است:
فاز جامد
امروزه بيشتر از پليت هاي 69 خانه اي بعنوان فاز جامد استفاده مي شود. انواع انعطاف پذير و جداشدني از پلي وينيل کرايد و انواع
سخت و محکم از پلي استيرن ساخته مي شوند. هم اکنون شرکت هاي معتبر و متعددي به ساخت انواع مختلف پليت هاي الايزا
مشغول هستند دربعضي از انواع اين پليت ها، کف چاهک ها صاف و تخت بوده و بعضي ديگر مقعر مي باشند.
بعضي از پليت ها داراي خاصيت چسبندگي بالا بوده و بعضي داراي چسبندگي متوسط مي باشند. امروزه آزمايشهاي متعددي با
موفقيت با هر کدام از اين نوع پليت ها انجام مي شود و نمي توان گفت که قطعا کدام نوع پليت برتري بر ديگر انواع پليت ها دارد.
مي توان با انجام دو آزمايش الايزاي کاملا يکسان که تنها در نوع پليت متفاوتند و بررسي نتايج تشخيص داد که براي کدام نوع از